通过这种方法，我们可以准确地确定单个造血干细胞中的突变数量。这些突变可用于破译突变过程和解剖造血的血统。我们的方法避免了使用全基因组扩增技术，通过体外克隆造血干细胞，从而降低误差率，有利于下游分析。
造血干细胞基因组中的突变模式可以揭示它们所接触的突变和DNA修复过程。从制备样品材料和染色开始，如文本协议所述，然后制备25毫升造血干细胞和祖细胞，或HSPC培养基。在每个井中用 75 微升 HSPC 培养介质填充细胞培养 384 井板。
为防止外井中的介质蒸发，请向外井中加注75微升无菌水或PBS，不要使用这些水井进行细胞分选。正确排序可行信号 HSPCs 是该协议中最关键的步骤。根据染色样品中 10，000 个单元格中的未染色控件设置 HSPC 排序的门。
通过围绕线性向前散射高度与向前散射面积分数绘制栅极单个单元。使用未污染的控制分数为血统分数绘制栅极。为 CD34 阳性细胞绘制门，通过为 CD38 阴性、CD45RA 阴性细胞设置特定门来进一步描述此子集。
在传真机上加载 384 井板，对单个单元进行排序。如果适用于传真机，则切换选项以保留索引排序数据，以启用对已排序单元格的回溯。要培养单独排序的 HSCs，请用透明聚乙烯包装将 384 井培养板与盖子进行包装。
将384井板转移到加湿的37摄氏度培养箱中，用5%的二氧化碳将其留在孵化器中三到四周，直到可见的克隆出现。经过四周的栽培，确定哪些井的汇合率为30%或更高。对于每个圆锥体，预填充1.5毫升微管，1毫升1%BSA和PBS，并根据相应的孔标记管。
使用 1%BSA 和 PBS 预湿移液器尖端，以最大限度地减少粘附在移液器尖端的细胞数量。在将 200 微升移液器设置为 75 微升时，在上下大力移液介质至少五次。收集与井对应的标记微管中的细胞悬浮液。
在井中重复管道，用高达 75 微升的新鲜 1%BSA 和 PBS，以确保最大限度吸收细胞。克隆培养的细胞可以粘在井底。使用标准的倒置光学显微镜检查油井，以确保是否收集了所有细胞。
如果所有汇合量大于 30% 的井都已收获，请将 384 孔板放回孵化器中。克隆培养可以扩散长达五周。在350倍g下旋转细胞悬浮液5分钟。
一个小颗粒应该是可见的。小心地取出除约五微升的上一时。细胞颗粒可以在零下20摄氏度下冷冻，并在DNA分离前储存数月。
在线数的第一个分支中存在的突变也将在散装样本中以亚克隆方式存在。以后的分支血统仅由 HSPC 之间共享的突变定义。要识别存在于克隆子集中的突变，并存在于散装中，首先筛选克隆之间共享的体细胞突变。
在基于 Unix 的终端中，编辑筛选器。ne 文件来设置拍子并调整其他参数。运行过滤器。
pi 脚本。使用确定低VAF散装的亚克洛纳存在于散装的突变的过滤器。r 基于 Unix 的终端中的脚本。
这将为共享和唯一的单核苷酸变种生成单独的 vcf 文件。通过重叠所有突变位置，确定散装样本中不存在的克隆之间共享的所有突变。使用综合基因组查看器（缩写 IGV）手动检查排除误报。
当突变存在于所有克隆的萌芽系中或存在于映射不良的区域时，突变被视为假。真正的突变可以在两个克隆之间共享，也可以在散装中分体存在。使用目标或桑格测序独立恢复所有共享位点。
使用共享突变构建突变与序列克隆的二进制表，零表示突变不存在，一个指示突变存在。使用基于 R 函数的突变二进制表输出为热图，并输出树突图，指示基于 R 的函数的细胞之间的血统关系。热图指示每个细胞的突变状态。
显示为控件 3 c 生成的复制编号分析的示例输出，用于检查副本编号更改。由单核苷酸变异滤波创建的变异等位分数图是样品中变异等位频率的直方图。密度图中 0.5 的峰值表示样本是克隆的。
这里描述的是一个典型的突变模式分析，产生96三核苷酸图。除了量化不同的突变类型外，还可以使用此工具进行签名提取。使用 IGV 验证克隆之间共享或存在于细菌系控件中的克隆中的突变。
当存在于样本中时，突变被认为是真的，而不是在细菌系中的高变异等位基因频率水平。当 IGV 中不存在时，突变被视为错误，这可能发生在映射不良的区域。在其他情况下，单核苷酸变异过滤检测到的事件是错过的细菌系变异。
对于选定克隆中的这些突变，强烈建议通过定向再分会独立重新分选突变。在检测克隆之间共享体细胞突变后，生成二元矩阵，构建一个热图，其中包含有或没有共享突变的细胞 A 通过 M. 指示发育血统树。作为此处介绍的元的下一步，可以使用突变特征分析确定血细胞中活跃的突变过程。
