Con este método, podemos determinar con precisión el número de mutaciones en una sola célula madre hematopoyética. Estas mutaciones se pueden utilizar para descifrar procesos mutacionales y diseccionar linajes hematopoyéticos. Nuestro método evita el uso de técnicas de amplificación del genoma completo mediante la clonación de las células madre hematopoyéticas in vitro, lo que resulta en menores tasas de error y beneficia el análisis posterior.
Los patrones mutacionales presentes en los genomas de las células madre hematopoyéticas pueden revelar los procesos mutagénicos y de reparación del ADN a los que fueron expuestos. Comience este procedimiento con la preparación de material de muestra y la tinción como se describe en el protocolo de texto, luego prepare 25 mililitros de tallo hematopoyético y célula progenitora, o medio de cultivo HSPC. Llenar un cultivo celular 384 bien-placa con 75 microlitros de medio de cultivo HSPC en cada pozo.
Para evitar la evaporación del medio en los pozos exteriores, llene los pozos exteriores con 75 microlitros de agua estéril o PBS, y no utilice estos pozos para la clasificación celular. La clasificación correcta de HSPC de señal viable es el paso más crítico en este protocolo. Establezca puertas para la clasificación HSPC basadas en un control no manchado en 10.000 celdas de la muestra manchada.
Puerta de celdas individuales dibujando una puerta alrededor de la altura de dispersión hacia delante lineal frente a la fracción de área de dispersión hacia adelante. Utilice la fracción de control no mantenida para dibujar una puerta para la fracción de linaje. Dibuje puertas para celdas positivas CD34 y caracterice aún más este subconjunto estableciendo una puerta específica para las células negativas CD38 negativas, CD45RA.
Cargue la placa de 384 pozos en la máquina de fax y clasifre las celdas individuales. Si es aplicable al equipo de fax, active la opción para mantener los datos de ordenación de índices para habilitar el retroceso de las celdas ordenadas. Para cultivar HSC clasificados por separado, envuelva la placa de cultivo de 384 pozos con tapa en envoltura de polietileno transparente.
Transfiera la placa de 384 pozos a una incubadora humidificada de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y manténgala en la incubadora durante tres a cuatro semanas hasta que aparezcan clones visibles. Después de cuatro semanas de cultivo, determinar qué pozos tienen una confluencia de 30%o superior. Para cada cono, rellene previamente microtubos de 1,5 mililitros con un mililitro de 1%BSA y PBS y e etiquete el tubo según el pozo correspondiente.
Pre-mojar una punta de pipeta con 1%BSA y PBS para minimizar el número de células que se pegan a la punta de la pipeta. Pipetee vigorosamente el medio hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces mientras raspa la parte inferior del pozo con la pipeta de 200 microlitros en 75 microlitros. Recoger la suspensión celular en el microtubo etiquetado que corresponde al pozo.
Repita la tubería en el pozo con hasta 75 microlitros de 1%BSA y PBS frescos para asegurar la máxima absorción de células. Las células cultivadas clonalmente pueden adherirse al fondo del pozo. Inspeccione los pozos utilizando un microscopio de luz invertido estándar para asegurarse de que se han recogido todas las células.
Si se han cosechado todos los pozos con una confluencia superior al 30%, vuelva a colocar la placa de 384 pozos en la incubadora. Las culturas clonales pueden proliferar hasta por cinco semanas. Gire hacia abajo la suspensión celular durante cinco minutos a 350 veces g.
Un pequeño pellet debe ser visible. Retire con cuidado todos los microlitros del sobrenadante, excepto unos cinco. Los pellets celulares pueden congelarse a menos 20 grados centígrados y almacenarse durante varios meses antes del aislamiento del ADN.
Las mutaciones presentes en las primeras ramas del lineagery también estarán presentes sub clonalmente en la muestra a granel. Los linajes de bifurcación posteriores se definen por mutaciones compartidas únicamente entre HSPC. Para identificar mutaciones que están presentes en un subconjunto de los clones y subclonaly presentes en el volumen, primer filtro para mutaciones somáticas compartidas entre clones.
En un terminal basado en Unix, edite el filtersomatic. ne para establecer los pats y ajustar los demás parámetros. Ejecute el filtersomatic.
pi script. Filtrar para las mutaciones que están subclonaly presentes en el volumen utilizando el bajo bajovaF a granel. r script en un terminal basado en Unix.
Esto generará archivos vcf separados para variantes de nucleótidos únicas y compartidas. Determinar todas las mutaciones compartidas entre clones que no están presentes en la muestra a granel, superponiendo todas las posiciones de mutación. Excluya falsos positivos mediante inspección manual mediante Visor Genómico Integrativo, abreviado IGV.
Las mutaciones se consideran falsas cuando no están presentes cuando la mutación está presente en la línea germinal en todos los clones o cuando están presentes en regiones mal mapeadas. Las mutaciones verdaderas pueden compartirse entre dos clones o estar subclonificados a granel. Resecuenciar todos los loci compartidos de forma independiente mediante la secuenciación dirigida o sanger.
Utilice las mutaciones compartidas para construir una tabla binaria de mutaciones frente a clones secuenciados, con cero que indique que la mutación no está presente y una que indica la presencia de la mutación. Salida de la tabla binaria de mutación como un mapa de calor junto con un dendrograma que indica las relaciones de linaje entre las células mediante funciones basadas en R. El mapa de calor indica el estado de mutación de cada célula.
Se muestra como una salida de ejemplo del análisis de número de copia generado por el control tres c para comprobar si hay alteraciones del número de copia. La gráfica de fracción de alelo variante creada por un solo filtrado de variantes de nucleótidos, es un histograma de frecuencias de alelo variante en la muestra. Un pico en la gráfica de densidad en 0,5 indica que la muestra es clonal.
Aquí se representa un análisis típico de patrones mutacionales que produce una gráfica de 96 trinucleótidos. Además de la cuantificación de diferentes tipos de mutaciones, la extracción de firmas también se puede realizar con esta herramienta. Las mutaciones compartidas entre clones o presentes en un clon en el control de la línea germinal se validan mediante IGV.
Las mutaciones se consideran verdaderas cuando están presentes en la muestra y no a niveles altos de frecuencia de alelos variantes en la línea germinal. Las mutaciones se consideran falsas cuando no están presentes en el IGV, lo que puede ocurrir en regiones mal mapeadas. En otros casos, los eventos detectados por el filtrado de variantes de nucleótidos individuales se pierden variantes germinales.
La resecuenciación independiente de mutaciones mediante la resecuenciación dirigida es muy recomendable para estas mutaciones en clones seleccionados. Después de la detección de mutaciones somáticas compartidas entre clones, se genera una matriz binaria, se construye un mapa de calor que contiene células con y sin las mutaciones compartidas A a M.Se indica el árbol de linaje de desarrollo. Como siguiente paso para el meta presentado aquí, los procesos mutacionales activos en células madre hemopoyéticas se pueden determinar mediante el análisis de firma mutacional.
