이 방법을 사용하면 단일 조혈 줄기 세포에서 돌연변이 수를 정확하게 결정할 수 있습니다. 이 돌연변이는 돌연변이 프로세스를 해독하고 조혈 혈통을 해부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 우리의 방법은 체외에서 조혈 줄기 세포를 복제하여 전체 게놈 증폭 기술의 사용을 방지하여 다운스트림 분석의 오차율과 이점을 초래합니다.
조혈 줄기 세포의 게놈에 존재하는 돌연변이 패턴은 그들이 노출된 돌연변이 및 DNA 복구 프로세스를 밝힐 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 샘플 재료의 제조 및 염색으로 이 절차를 시작한 다음 조혈 줄기 및 선조 세포 또는 HSPC 배양 배지의 25 밀리리터를 준비합니다. 각 웰에 75 마이크로리터의 HSPC 배양 배지로 세포 배양 384웰 플레이트를 채웁니다.
외부 우물에서 배지의 증발을 방지하기 위해, 멸균 물 또는 PBS의 75 마이크로 리터와 외부 우물을 채우고, 세포 분류에 이러한 우물을 사용하지 마십시오. 실행 가능한 신호 HSPC의 올바른 정렬은 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 스테인드 샘플에서 10, 000 셀에서 스테인드 되지 않은 제어를 기반으로 HSPC 정렬게이트를 설정합니다.
선형 전방 분산 높이 대 전방 분산 영역 분획 주위에 게이트를 그리는 게이트 단일 셀. 스테인드 되지 않은 컨트롤 분획을 사용하여 계보 분수의 게이트를 그립니다. CD34 양수 세포에 대한 게이트를 그리고 CD38 음성, CD45RA 음성 셀에 대한 특정 게이트를 설정하여 이 하위 집합을 더욱 특성화합니다.
팩스 기에 384웰 플레이트를 로드하고 단일 셀을 정렬합니다. 팩스 기에 해당하는 경우 인덱스 정렬 데이터를 유지하여 정렬된 셀을 다시 볼 수 있도록 하는 옵션을 전환합니다. SMC를 교양하려면 투명한 폴리에틸렌 랩으로 뚜껑으로 384웰 배양판을 감쌉시다.
384웰 플레이트를 5%의 이산화탄소로 가습된 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮기고 눈에 보이는 클론이 나타날 때까지 3~4주 동안 인큐베이터에 보관하십시오. 배양 의 4 주 후, 어떤 우물의 합류가 결정 30% 이상. 각 콘에 대해, 1%BSA와 PBS의 1밀리리터로 1.5 밀리리터 마이크로튜브를 미리 채우고 해당 우물에 따라 튜브에 라벨을 붙입니다.
파이펫 팁에 달라붙는 셀수를 최소화하기 위해 1%BSA 및 PBS로 파이펫 팁을 미리 적시합니다. 75 마이크로리터로 설정된 200 마이크로리터 파이펫으로 우물 바닥을 긁으면서 배지를 위아래로 5회 이상 격렬하게 피펫합니다. 우물에 해당하는 표지된 마이크로튜브에서 세포 현탁액을 수집합니다.
최대 75마이크로리터의 신선한 1%BSA 및 PBS를 사용하여 세포의 최대 섭취량을 보장합니다. 복제 배양 된 세포는 우물의 바닥에 충실 할 수 있습니다. 모든 세포가 수집되었는지 확인하기 위해 표준, 반전 된 빛 현미경을 사용하여 우물을 검사합니다.
30% 이상의 응력을 가진 모든 우물이 수확된 경우, 384웰 플레이트를 인큐베이터에 다시 놓습니다. 복제 배양은 최대 5주 동안 증식할 수 있습니다. 세포 현탁액을 350배 g에서 5분간 회전시합니다.
작은 펠릿을 볼 수 있어야 합니다. 상체의 약 5 마이크로 리터를 제외한 모든 것을 조심스럽게 제거하십시오. 세포 펠릿은 영하 20도에서 동결되고 DNA 격리 전에 여러 달 동안 보관할 수 있습니다.
혈통의 첫 번째 가지에 존재하는 돌연변이는 또한 벌크 샘플에 서브 복제존재될 것이다. 이후 분기 혈통은 HSPC 간에만 공유되는 돌연변이에 의해 정의됩니다. 클론의 하위 집합에 존재하는 돌연변이를 식별하고 대량에 미묘하게 존재하는 돌연변이를 확인하기 위해, 클론 사이에 공유되는 체성 돌연변이에 대한 첫 번째 필터.
유닉스 기반 터미널에서 필터링을 편집합니다. ne 파일은 퍼트를 설정하고 다른 매개 변수를 조정합니다. 필터 를 실행합니다.
파이 스크립트. 낮은VAF 벌크를 사용하여 대량에서 아끼고 존재하는 돌연변이를 위한 필터. 유닉스 기반 터미널의 r 스크립트입니다.
이렇게 하면 공유 및 고유 단일 뉴클레오티드 변이체에 대해 별도의 vcf 파일을 생성합니다. 모든 돌연변이 위치를 겹쳐서 벌크 샘플에 존재하지 않는 클론 간에 공유되는 모든 돌연변이를 결정합니다. 통합 유전체 뷰어를 사용하여 수동 검사로 거짓 긍정을 제외, 약식 IGV.
돌연변이는 돌연변이가 모든 클론에 있는 생식선에서 존재할 때 또는 제대로 매핑된 지구에 있을 때 존재하지 않을 때 거짓으로 여겨됩니다. 참된 돌연변이는 2개의 클론 사이에서 공유될 수 있고 또는 대량에서 아끼게 존재할 수 있습니다. 표적 또는 sanger 시퀀싱을 사용하여 공유 된 모든 loci를 독립적으로 다시 시퀀싱합니다.
공유 돌연변이를 사용하여 돌연변이가 존재하지 않는다는 것을 나타내는 돌연변이 대 서열 클론대 돌연변이의 이진 테이블을 구축하고 돌연변이의 존재를 나타내는 돌연변이를 나타낸다. 돌연변이 바이너리 테이블을 R 기반 함수를 사용하여 세포 간의 계보 관계를 나타내는 dendrogram과 함께 열 맵으로 출력합니다. 열 맵은 각 셀의 돌연변이 상태를 나타냅니다.
복사 번호 변경을 확인하기 위해 제어 3 c에 의해 생성된 복사 번호 해석의 예제 출력으로 도시됨. 단일 뉴클레오티드 변이체 필터링에 의해 생성된 이체 알레일 분획 플롯은 시료내의 이체 알레일 주파수의 히스토그램이다. 밀도 플롯이 0.5의 피크는 샘플이 복제임을 나타냅니다.
여기에 묘사된 96개의 트리뉴클레오티드 플롯을 생성하는 전형적인 돌연변이 패턴 분석이 있습니다. 상이한 돌연변이 유형의 정량화 외에도 이 도구를 사용하여 서명 추출을 수행할 수도 있습니다. 클론 사이에 공유되거나 생식선 대조군에서 클론에 존재하는 돌연변이는 IGV를 사용하여 검증된다.
돌연변이는 생식선에 있는 높은 변이체 유전자 주파수 수준이 아닌 견본에 존재할 때 사실로 여겨됩니다. 돌연변이는 IGV에 존재하지 않을 때 거짓으로 간주됩니다, 이는 제대로 매핑 된 지역에서 발생할 수 있습니다. 다른 경우에, 단 하나 뉴클레오티드 변이체 필터링에 의해 검출된 사건은 생식선 이체를 놓친다.
표적 재퀀싱에 의한 돌연변이의 독립적인 재열은 선택된 클론에 있는 이 돌연변이를 위해 높게 추천됩니다. 클론 간의 공유 체세포 돌연변이를 검출한 후, 이진 매트릭스가 생성되고, M.를 통해 공유 돌연변이 A를 포함하는 열맵이 생성된다. 여기에 제시된 메타에 대한 다음 단계로, 혈우경 줄기 세포에서 활성 돌연변이 과정은 돌연변이 서명 분석을 사용하여 결정될 수 있다.
