Avec cette méthode, nous pouvons déterminer avec précision le nombre de mutations dans une seule cellule souche hématopoïétique. Ces mutations peuvent être utilisées pour déchiffrer les processus mutationnels et disséquer les lignées hématopoïétiques. Notre méthode évite l’utilisation de techniques d’amplification du génome entier en clonage des cellules souches hématopoïétiques in vitro, ce qui se traduit par des taux d’erreur plus faibles et des avantages d’analyse en aval.
Les modèles mutationnels présents dans les génomes des cellules souches hématopoïétiques peuvent révéler les processus mutogènes et de réparation de l’ADN auxquels elles ont été exposées. Commencez cette procédure avec la préparation du matériel d’échantillon et la coloration telle que décrite dans le protocole de texte, puis préparez 25 millilitres de tige hématopoïétique et de cellules progénitrices, ou milieu de culture HSPC. Remplissez une culture cellulaire 384 bien plaque avec 75 microlitres de milieu de culture HSPC dans chaque puits.
Pour éviter l’évaporation du milieu dans les puits extérieurs, remplissez les puits extérieurs de 75 microlitres d’eau stérile ou de PBS, et n’utilisez pas ces puits pour le tri cellulaire. Le tri correct des HSPCs de signal viables est l’étape la plus critique dans ce protocole. Placez des portes pour le tri HSPC basé sur un contrôle non taché dans 10 000 cellules de l’échantillon taché.
Portez les cellules simples en dessinant une porte autour de la hauteur de dispersion avant linéaire par rapport à la fraction de zone de dispersion avant. Utilisez la fraction de commande non tachée pour dessiner une porte pour la fraction de lignée. Dessinez des barrières pour les cellules positives CD34 et caractérisez davantage ce sous-ensemble en fixant une porte spécifique pour les cellules négatives CD38, CD45RA négatives.
Chargez la plaque de 384 puits sur le télécopieur et triez les cellules individuelles. S’il s’applique au télécopieur, basculez sur la possibilité de conserver les données de tri d’index pour permettre le retracage des cellules triées. Pour la culture ment triés HSCs, envelopper la plaque de culture de 384 puits avec couvercle dans un enveloppement transparent en polyéthylène.
Transférer la plaque de 384 puits dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et la conserver dans l’incubateur pendant trois à quatre semaines jusqu’à ce que des clones visibles apparaissent. Après quatre semaines de culture, déterminez quels puits ont une confluence de 30 % ou plus. Pour chaque cône, préfillez des microtubes de 1,5 millilitre avec un millilitre de 1%BSA et PBS et étiquetez le tube selon le puits correspondant.
Pré-mouiller une pointe pipette avec 1%BSA et PBS pour minimiser le nombre de cellules collant à la pointe pipette. Pipette vigoureusement le milieu de haut en bas au moins cinq fois tout en raclant le fond du puits avec la pipette de 200 microlitres réglée à 75 microlitres. Recueillir la suspension cellulaire dans le microtube étiqueté qui correspond au puits.
Répétez la tuyautage dans le puits avec jusqu’à 75 microlitres de 1%BSA frais et PBS pour assurer une absorption maximale des cellules. Les cellules de culture clonally peuvent coller au fond du puits. Inspecter les puits à l’aide d’un microscope léger inversé standard pour s’assurer que toutes les cellules ont été recueillies.
Si tous les puits dont la confluence est supérieure à 30 % ont été récoltés, remettre la plaque de 384 puits dans l’incubateur. Les cultures clonales peuvent proliférer jusqu’à cinq semaines. Faites tourner la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 350 fois g.
Une petite pastille doit être visible. Retirer soigneusement tous les microlitres du supernatant sauf environ. Les granulés cellulaires peuvent être congelés à moins 20 degrés Celsius et stockés pendant plusieurs mois avant l’isolement de l’ADN.
Les mutations présentes dans les premières branches de la lignée seront également sous-clonally présentes dans l’échantillon en vrac. Les lignées de branchement ultérieures sont définies par des mutations partagées entre les HSPCs seulement. Pour identifier les mutations présentes dans un sous-ensemble de clones et de sous-vêtements présents en vrac, premier filtre pour les mutations somatiques partagées entre clones.
Dans un terminal basé sur Unix, modifiez le filtersomatic. ne fichier pour régler les tapes et ajuster les autres paramètres. Exécutez le filtersomatic.
pi script. Filtre pour les mutations qui sont sous-vêtements présents dans le volume en utilisant le vrac déterminer lowVAF. r script dans un terminal basé sur Unix.
Cela générera des fichiers vcf distincts pour les variantes nucléotides uniques partagées et uniques. Déterminer toutes les mutations partagées entre les clones qui ne sont pas présents dans l’échantillon en vrac, en chevauchant toutes les positions de mutation. Exclure les faux positifs par inspection manuelle à l’aide d’Integrative Genomic Viewer, IGV abrégé.
Les mutations sont considérées comme fausses lorsqu’elles ne sont pas présentes lorsque la mutation est présente dans la lignée germinale de tous les clones ou lorsqu’elles sont présentes dans des régions mal cartographiées. Les véritables mutations peuvent être partagées entre deux clones ou être sous-vêtements présents en vrac. Resequence tous les loci partagés indépendamment en utilisant le séquençage ciblé ou sanger.
Utilisez les mutations partagées pour construire une table binaire de mutations par rapport aux clones séquencés, avec zéro indiquant que la mutation n’est pas présente et une indiquant la présence de la mutation. Sortie de la table binaire de mutation comme carte thermique avec un dendrogram indiquant les relations de lignée entre les cellules utilisant des fonctions basées sur R. La carte thermique indique l’état de mutation de chaque cellule.
Montré comme exemple de sortie de l’analyse du numéro de copie générée par le contrôle trois c pour vérifier les modifications du numéro de copie. L’intrigue de fraction d’allèle variante créée par le filtrage unique de variante de nucléotide, est un histogramme des fréquences d’allèle de variante dans l’échantillon. Un pic de la parcelle de densité à 0,5 indique que l’échantillon est clonal.
Représenté ici est une analyse des modèles mutationnels typiques produisant une parcelle de trinucléotide 96. En plus de la quantification de différents types de mutation, l’extraction de signature peut également être effectuée avec cet outil. Les mutations partagées entre clones ou présentes dans un clone dans le contrôle de la lignée germinale sont validées à l’aide d’IGV.
Les mutations sont considérées comme vraies lorsqu’elles sont présentes dans l’échantillon et non à des niveaux élevés de fréquence des allèles dans la lignée germinale. Les mutations sont considérées comme fausses lorsqu’elles ne sont pas présentes dans l’IGV, ce qui peut se produire dans des régions mal cartographiées. Dans d’autres cas, les événements détectés par le filtrage unique de variante de nucléotide sont des variantes manquées de germline.
Le reséquençage indépendant des mutations par reséquençage ciblé est fortement recommandé pour ces mutations chez certains clones. Après détection des mutations somatiques partagées entre les clones, une matrice binaire est générée, une carte thermique est construite contenant des cellules avec et sans les mutations partagées A à M.L’arbre de lignée développementale est indiqué. Comme prochaine étape pour la méta présentée ici, les processus mutationnels actifs dans les cellules souches hémopoïétiques peuvent être déterminés à l’aide de l’analyse de signature mutationnelle.
