Mit dieser Methode können wir die Anzahl der Mutationen in einer einzelnen hämatopoetischen Stammzelle genau bestimmen. Diese Mutationen können verwendet werden, um Mutationsprozesse zu entschlüsseln und hämatopoetische Linien zu sezieren. Unsere Methode vermeidet den Einsatz von Vollgenom-Amplifikationstechniken durch Klonen der hämatopoetischen Stammzellen in vitro, was zu niedrigeren Fehlerraten führt und eine nachgelagerte Analyse begünstigt.
Die Mutationsmuster in den Genomen hämatopoetischer Stammzellen können die mutagenen und DNA-Reparaturprozesse aufdecken, denen sie ausgesetzt waren. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung von Probenmaterial und Färbung, wie im Textprotokoll beschrieben, und bereiten Sie dann 25 Milliliter hämatopoetischen Stamm und Vorläuferzelle oder HSPC-Kulturmedium vor. Füllen Sie eine Zellkultur 384 Well-Platte mit 75 Mikroliter HSPC Kulturmedium in jedem Brunnen.
Um eine Verdunstung des Mediums in den äußeren Brunnen zu verhindern, füllen Sie die äußeren Brunnen mit 75 Mikroliter sterilem Wasser oder PBS und verwenden Sie diese Brunnen nicht für die Zellsortierung. Die korrekte Sortierung von hSPCs für lebensfähige Signale ist der wichtigste Schritt in diesem Protokoll. Stellen Sie Tore für die HSPC-Sortierung auf der Grundlage einer ungefärbten Steuerung in 10.000 Zellen aus der gebeizten Probe ein.
Beorchen Sie einzelne Zellen, indem Sie ein Tor um die lineare Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zum Punktierbereich nach vorne zeichnen. Verwenden Sie die ungefärbte Kontrollfraktion, um ein Tor für die Abstammungsfraktion zu zeichnen. Zeichnen Sie Tore für CD34-positive Zellen und charakterisieren Sie diese Teilmenge weiter, indem Sie ein bestimmtes Gate für CD38-negative CD45RA-Negativzellen setzen.
Laden Sie die 384-Well-Platte auf das Faxgerät und sortieren Sie einzelne Zellen. Wenn für das Faxgerät anwendbar, schalten Sie die Option zum Beibehalten von Indexsortierdaten ein, um die Rückverfolgung der sortierten Zellen zu ermöglichen. Um singart sortierte HSCs zu kulturieren, wickeln Sie die 384-Well-Kulturplatte mit Deckel in transparente Polyethylenfolie.
Übertragen Sie die 384-Well-Platte auf einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid und halten Sie sie drei bis vier Wochen im Inkubator, bis sichtbare Klone erscheinen. Bestimmen Sie nach vier Wochen Kultivierung, welche Brunnen eine Konfluenz von 30% oder höher haben. Für jeden Kegel 1,5 Milliliter Mikroröhren mit einem Milliliter 1%BSA und PBS vorfüllen und das Rohr entsprechend dem entsprechenden Brunnen beschriften.
Vorbefeuchten einer Pipettenspitze mit 1%BSA und PBS, um die Anzahl der Zellen zu minimieren, die an der Pipettenspitze kleben. Das Medium mindestens fünfmal kräftig nach oben und unten pipette, während der Boden des Brunnens mit der 200-Mikroliter-Pipette auf 75 Mikroliter abkratzt wird. Sammeln Sie die Zellsuspension in der beschrifteten Mikroröhre, die dem Brunnen entspricht.
Wiederholen Sie die Pipettierung im Brunnen mit bis zu 75 Mikrolitern frischer 1%BSA und PBS, um eine maximale Aufnahme der Zellen zu gewährleisten. Klonal kultivierte Zellen können am Boden des Brunnens kleben. Prüfen Sie die Brunnen mit einem standardierten, invertierten Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt wurden.
Wenn alle Brunnen mit mehr als 30% Konfluenz geerntet wurden, legen Sie die 384-Well-Platte wieder in den Inkubator. Klonkulturen können sich bis zu fünf Wochen lang ausbreiten. Drehen Sie die Zellsuspension für fünf Minuten bei 350 mal g.
Ein kleines Pellet sollte sichtbar sein. Entfernen Sie vorsichtig alle bis auf etwa fünf Mikroliter des Überstandes. Zellpellets können bei minus 20 Grad Celsius eingefroren und mehrere Monate vor der DNA-Isolierung gelagert werden.
Mutationen, die in den ersten Zweigen der Abstammung vorhanden sind, werden auch subklonal in der Massenprobe vorhanden sein. Spätere Verzweigungslinien werden durch Mutationen definiert, die nur von HSPCs gemeinsam genutzt werden. Um Mutationen zu identifizieren, die in einer Teilmenge der Klone vorhanden sind und subklonierend in der Masse vorhanden sind, filtert zuerst somatische Mutationen, die zwischen Klonen gemeinsam genutzt werden.
Bearbeiten Sie in einem Unix-basierten Terminal die Filtersomatik. ne-Datei, um die Pats einzustellen und die anderen Parameter anzupassen. Führen Sie die Filtersomatik aus.
pi-Skript. Filter für Mutationen, die subklonaly in der Masse vorhanden sind, mit der bestimmen lowVAF Masse. r-Skript in einem Unix-basierten Terminal.
Dadurch werden separate vcf-Dateien für gemeinsam genutzte und eindeutige Single-Nukleotid-Varianten generiert. Bestimmen Sie alle Mutationen, die von Klonen gemeinsam genutzt werden, die nicht in der Massenstichprobe vorhanden sind, indem Sie alle Mutationspositionen überlappen. Schließen Sie falsche Positivmeldungen durch manuelle Inspektion mit Integrative Genomic Viewer, abgekürzt IGV, aus.
Mutationen gelten als falsch, wenn sie nicht vorhanden sind, wenn die Mutation in allen Klonen in der Keimbahn vorhanden ist oder wenn sie in schlecht kartierten Regionen vorhanden sind. Wahre Mutationen können zwischen zwei Klonen geteilt werden oder subkloniert in der Masse vorhanden sein. Resequence alle freigegebenen loci unabhängig mit gezielten oder Sanger-Sequenzierung.
Verwenden Sie die freigegebenen Mutationen, um eine binäre Tabelle von Mutationen im Vergleich zu sequenzierten Klonen zu erstellen, wobei Null darauf hinweist, dass die Mutation nicht vorhanden ist, und eine, die auf das Vorhandensein der Mutation hinweist. Geben Sie die Mutationsbinärtabelle als Heatmap zusammen mit einem Dendrogramm aus, das Linienbeziehungen zwischen Zellen mit R-basierten Funktionen angibt. Die Heatmap zeigt den Mutationsstatus für jede Zelle an.
Als Beispielausgabe der Kopiernummernanalyse, die von Steuerelement drei c generiert wurde, um nach Änderungen der Kopiernummer zu suchen. Die Variante Allelfraktionsdiagramm, das durch einzelne Nukleotid-Variantenfilterung erzeugt wird, ist ein Histogramm der Variantenallelfrequenzen in der Probe. Ein Spitzenwert im Dichtediagramm bei 0,5 gibt an, dass die Probe klonal ist.
Hier ist eine typische Mutationsmusteranalyse dargestellt, die eine 96 Trinukleotid-Diagramm produziert. Neben der Quantifizierung verschiedener Mutationstypen kann mit diesem Werkzeug auch die Signaturextraktion durchgeführt werden. Mutationen, die unter Klonen geteilt werden oder in einem Klon in der Keimbahnkontrolle vorhanden sind, werden mit IGV validiert.
Mutationen gelten als wahr, wenn sie in der Probe vorhanden sind und nicht bei hohen Varianten-Allel-Frequenzen in der Keimbahn. Mutationen gelten als falsch, wenn sie in der IGV nicht vorhanden sind, was in schlecht kartierten Regionen geschehen kann. In anderen Fällen werden Ereignisse, die durch die Filterung einzelner Nukleotid-Varianten erkannt werden, Keimbahnvarianten übersehen.
Für diese Mutationen in ausgewählten Klonen wird eine unabhängige Resequenzierung von Mutationen durch gezielte Resequenzierung empfohlen. Nach dem Nachweis gemeinsamer somatischer Mutationen zwischen Klonen wird eine binäre Matrix erzeugt, eine Heatmap wird erstellt, die Zellen mit und ohne die gemeinsamen Mutationen A bis M enthält. Als nächster Schritt für das hier vorgestellte Meta können Mutationsprozesse, die in hämopoetischen Stammzellen aktiv sind, mittels mutationaler Signaturanalyse bestimmt werden.
