Rhabdomyosarcoma 是一种罕见的软组织肉瘤形式，以组织学特征为组织形态和 myogenic 标记的表达。然而，鉴于这些肿瘤的不同亚型的存在，以及促成其形成的刺激的异质性，确定原生细胞是非常具有挑战性的。在这里，我们描述了从从小鼠新鲜收获的肿瘤组织开始鉴定罗巴多米瘤起源细胞的可重复和可靠的方法，这种测定是肿瘤球形成测定。
肿瘤球形成分析的主要优点是，它依赖于已知存在于肿瘤原细胞中的细胞特性，它也可用于特定细胞群体的扩张和富集。此外，其球体结构模仿肿瘤环境，因此可用作药物筛选研究。这种方法有可能应用于其他类型的肿瘤，因为它不需要事先了解分子标记，但它可能需要优化培养条件。
肿瘤球可能需要一些时间才能形成，特别是如果试图识别肿瘤内罕见的细胞群体。因此，不建议每天看你的亚文化板，因为它可能会对你的实验结果产生负面影响。首先在37摄氏度的培养箱中用5毫升隔离介质加热10厘米的板。
重500至1000毫克的肿瘤组织，并放在盘子里。将带肿瘤组织的盘子带到无菌培养罩中，用剃刀刀片切碎。为了获得最佳的消化效果，请确保碎片的大小是均匀的。
将切碎的组织和细胞隔离介质转移到 15 毫升离心管中。再用四毫升介质清洗盘子，然后加到管子里。每毫升胶原酶溶液加入700单位，在37摄氏度的摇水浴中孵育1个半小时。
孵育后，在室温下以300倍g旋转组织5分钟。在不破坏颗粒的情况下吸升上一液，然后将颗粒重新在10毫升的第二消化溶液中，并在摇水浴中孵育30分钟以上。第二次消化后，移液器将细胞悬浮液上下移液，并通过50毫升离心管上的70微米尼龙过滤器。
然后用10毫升的细胞隔离介质清洗过滤器，以300倍g旋转下组织5分钟。吸制上一提液，并在肿瘤细胞介质的20毫升中重新暂停颗粒。将悬浮液转移到15厘米培养板，并一夜之间将细胞放在37摄氏度的培养箱中。
第二天，改变介质以清除可能对细胞生存产生负面影响的碎片和死细胞。此时，评估细胞汇合，让细胞在培养箱中生长，直到它达到90%，每天监测细胞，每两天更换一次培养。对于肿瘤球衍生，使用通道P1或P2的细胞，以避免细胞通过多个通道选择。
用 PBS 清洗细胞盘，然后用分离溶液盖住它们。将它们放在培养箱中5至10分钟，然后在明亮的显微镜下观察盘子，确认分离。一旦细胞分离，将肿瘤细胞介质添加到板中，并将细胞悬浮液转移到离心管。
将细胞以300倍g旋转5分钟，去除上心，并在肿瘤球介质中重新暂停细胞。重新发送细胞后，使用 Trypan 蓝色计算细胞并计算细胞浓度。将适当数量的细胞板在96井的低附板中，将细胞放在培养箱中，直到实验结束，除非补充介质，否则注意不要打扰板。
实验完成后，在明亮的领域显微镜下或使用Celigo软件手动识别肿瘤球。肿瘤球的数量和大小可以通过这种测定进行评估。为了准备肿瘤球进行全血移植，请将从特定细胞类型或治疗中获得的所有肿瘤球汇集在一起。
离心肿瘤球，小心地用一毫米移液器取出上流液，然后用200微升移液器清洗，然后用10毫升无菌PBS清洗。再次旋转肿瘤球并吸气 PBS。在肿瘤球颗粒顶部的一毫升细胞分离溶液中加入500微升，在37摄氏度的摇晃水浴中孵育细胞。
每10分钟检查一次消化进度。整个过程最多需要 30 分钟。如果震动水浴中肿瘤球的消化不足以获得单细胞溶液，则建议通过上下移液进行机械干扰。
请注意，旋转肿瘤球后不会形成稳定的颗粒，因此应用一毫升移液器和200微升移液器小心吸升。获得单细胞溶液后，加入一卷肿瘤细胞介质，以300倍g旋转，在4摄氏度下旋转5分钟。离心后，所有后续步骤都必须在冰上执行。
在冷肿瘤细胞培养中重新发送细胞，并使用 Trypan 蓝色排除计数活细胞。确定正常数量的细胞，并在50微升的冷肿瘤细胞介质中稀释。将移液器尖端放在冷肿瘤细胞介质中冷却，然后用它来服用 50 微升的冷 ECM 溶液，然后用细胞将其添加到管中，确保在这个过程中不要从冰中去除 ECM 管。
在移植之前将细胞保持在冰上，并在冰上放置一个带盖的0.5毫升胰岛素注射器，并放置一个29量针。在确认小鼠已正确麻醉后，剃掉动物的右侧，将细胞溶液吸入冷却的注射器中，然后将细胞皮下注射到剃光区域。如果注射正确执行，皮肤下将形成可见的凸起。
该协议可用于可靠地形成肿瘤球，用于识别负责软组织肉瘤发育的稀有细胞群。这种测定的一个基本部分是肿瘤球和细胞群之间的区分，它们表现出明显的形态差异。为了确定感兴趣的蛋白质对肿瘤细胞产生影响的最佳浓度，有必要评估蛋白质下游靶点表达水平。
三个测试的基因显示对重组蛋白治疗有剂量依赖性反应，1个没有。为了建立有效的方案，分析了转染对固有肿瘤细胞的影响;对两种不同量的试剂进行了检测，用GFP-报告粒评估了效率。减少试剂量可提高转染效率。
必须实施两步协议，对悬浮细胞进行转染。在粘附细胞上进行转染，24小时后分离并悬浮镀上;7天后，受控肿瘤球表达GFP。肿瘤球获得、治疗和移植后，可以比较这种不同治疗对体内肿瘤生长的影响。
这些方法将使科学家能够回答Rhabdomyosarcomas细胞的仍然存在的问题，同时为药物筛查确定基础。
