Rhabdomyosarcoma는 조직 형태와 근생 마커의 발현에 의해 조직학적으로 특징짓는 연조직 육종의 드문 형태이다. 그러나, 이러한 종양의 다른 특수형의 존재와 그것의 형성에 기여하는 자극의 이질성을 감안할 때, 기원의 세포의 식별은 매우 도전적이었습니다. 여기서 우리는 생쥐로부터 새로 수확한 종양 조직에서 시작하여 rhabdomyosarcomas의 기원세포의 식별을 위한 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명하고 이 분석법은 종양권 형성 분석이다.
종양권 형성 분석의 주요 장점은 종양 유래 세포에 존재하는 것으로 알려진 세포 특성에 의존하며 특정 세포 집단의 팽창 및 농축에도 사용될 수 있다는 것입니다. 더욱이, 그것의 스페로이드 구조는 종양 환경을 모방, 따라서 그(것)들은 약 검열 연구 결과로 이용될 수 있습니다. 이 방법은 분자 마커의 사전 지식이 필요하지 않기 때문에 종양의 다른 유형에 적용 될 수있는 잠재력을 가지고 있지만 문화 조건의 최적화를 필요로 할 수 있습니다.
종양권은 특히 종양 내의 희귀 세포 집단을 식별하려고 시도하는 경우 형성하는 데 시간이 걸릴 수 있습니다. 따라서 실험 결과에 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문에 매일 하위 문화 판을 보는 것이 좋습니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5밀리리터의 격리 미디어가 있는 10센티미터 플레이트를 데우기 시작합니다.
종양 조직의 500 ~ 1, 000 밀리그램의 무게를 측정하고 접시에 놓습니다. 종양 조직으로 접시를 멸균 배양 후드에 가져와 면도날로 다진다. 최적의 소화를 위해 다진 조각의 크기가 균일한지 확인하십시오.
다진 조직 및 세포 격리 매체를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 또 다른 4 밀리리터의 미디어로 접시를 씻고 튜브에 추가합니다. 콜라게나제 용액 의 밀리리터 당 700 단위를 튜브에 추가하고 1 1/2 시간 동안 섭씨 37도에서 흔들리는 수조에 배양하십시오.
인큐베이션 후 실온에서 5분 동안 300배 g로 조직을 회전시합니다. 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄을 흡인한 다음, 펠릿을 10밀리리터의 두 번째 소화 용액으로 재복제하고 흔들리는 수조에서 30분 동안 배양합니다. 두 번째 소화 후, 파이펫 은 위아래로 셀 서스펜션을 하고 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 70 마이크로 미터 나일론 필터를 통과합니다.
그런 다음 10 밀리리터의 세포 격리 매체로 필터를 세척하고 5 분 동안 300 배 g에서 조직을 회전시하십시오. 상류체를 흡인하고 종양 세포 매체의 20 밀리리터에서 펠릿을 재중단한다. 서스펜션을 15센티미터 배양판으로 옮기고 세포를 섭씨 37도인배양식에 하룻밤 사이에 놓습니다.
다음 날, 세포 생존에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 파편과 죽은 세포를 제거하기 위하여 매체를 변경합니다. 이 시점에서, 세포 소모성을 평가하고 세포가 매일 세포를 90%에 도달할 때까지 인큐베이터에서 성장하는 것을 허용하고 2일마다 미디어를 변경합니다. 종양경부 파생의 경우, 통로 P1 또는 P2에서 세포를 사용하여 여러 구절을 통해 세포 선택을 피하십시오.
셀 접시를 PBS로 씻은 다음 분리 용액으로 덮습니다. 인큐베이터에 5-10분 간 배치한 다음 밝은 필드 현미경 으로 플레이트를 보고 분리를 확인합니다. 일단 세포가 분리되면, 종양 세포 매체를 플레이트에 추가하고 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮는다.
세포를 300배 g에서 5분간 스핀하고, 상체를 제거하고, 종양권 미디어에서 세포를 다시 분리한다. 세포를 다시 일시 중단 한 후 Trypan 파란색을 사용하여 셀 농도를 계산합니다. 96-잘 낮은 부착 플레이트에 있는 세포의 적당한 수를 접시및 실험의 끝까지 인큐베이터에 세포를 배치하고, 미디어를 보충하지 않는 한 판을 방해하지 않도록 주의하십시오.
실험이 완료된 후, 밝은 필드 현미경또는 Celigo 소프트웨어를 사용하여 수동으로 종양스피어를 식별합니다. 종양스피어의 수와 크기는 이 분석의 결과로 평가될 수 있다. 동종 이식 이식을 위한 종양스피어를 준비하려면 특정 세포 유형 또는 치료에서 얻은 모든 종양 스피어를 함께 당깁니다.
종양구를 원심 분리하고 1밀리미터 파이펫으로 상체를 조심스럽게 제거하고 200 마이크로리터 파이펫을 한 다음 멸균 PBS 10 밀리리터로 세척합니다. 종양구를 다시 회전시키고 PBS를 흡인시합니다. 500 마이크로리터를 종양권 펠릿 위에 세포 분리 용액 1밀리리터에 넣고 섭씨 37도에서 흔들리는 수조에서 세포를 배양합니다.
10분마다 소화진행을 확인합니다. 전체 프로세스는 최대 30분이 소요됩니다. 흔들리는 수조에서 종양권의 소화가 단일 세포 용액을 얻기에 충분하지 않은 경우, 위아래로 파이프를 통해 기계적 중단이 제안된다.
종양구를 회전한 후에는 안정된 펠릿을 형성하지 않으므로, 체퍼를 심는 것은 1밀리리터 파이펫과 200 마이크로리터 파이펫으로 신중하게 수행해야 합니다. 단일 세포 용액이 얻어지면 종양 세포 매체의 부피를 추가하고 섭씨 4도에서 5 분 동안 300 배 g로 회전하십시오. 이 원심 분리 후, 모든 후속 단계는 얼음에서 수행해야합니다.
차가운 종양 세포 매체에 있는 세포를 다시 중단하고 Trypan 청색 제외를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다. 동종 이식에 대한 적절한 수의 세포를 결정하고 감기 종양 세포 미디어의 50 마이크로 리터에서 희석하십시오. 차가운 종양 세포 매체에 파이펫 팁을 놓고 냉각한 다음 차가운 ECM 용액 50 마이크로리터를 사용하여 이 과정에서 얼음에서 ECM 튜브를 제거하지 않도록 세포가 있는 튜브에 추가합니다.
이식될 때까지 얼음 위에 세포를 유지하고 얼음 위에 29게이지 바늘로 덮인 0.5 밀리리터 인슐린 주사기를 놓습니다. 마우스가 제대로 마취되었음을 확인한 후 동물의 오른쪽을 면도하고, 세포 용액을 냉각 된 주사기로 흡수하고, 면도 부위에 피하 된 세포를 주입한다. 주사가 올바르게 수행되면 피부 아래에 눈에 보이는 범프가 형성됩니다.
이 프로토콜은 연조직 육종 발달을 담당하는 희귀 세포 집단의 식별을 위해 종양구체를 안정적으로 형성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석의 근본적인 부분은 명확한 형태학적 차이를 나타내는 종양권과 세포 클러스터 사이의 차별입니다. 관심 있는 단백질이 종양 세포에 영향을 미치는 최적의 농도를 결정하기 위해 단백질의 다운스트림 표적의 발현 수준을 평가할 필요가 있다.
시험된 유전자의 3개는 재조합 단백질 처리에 복용량 의존반응을 보였고 1개는 하지 않았다. 효율적인 프로토콜을 확립하기 위해 내재된 종양 세포에 대한 경질의 효과를 분석하였다.두 가지 상이한 양의 시약을 테스트하고 GFP-리포터 플라스미드로 효율성을 평가하였다. 시약의 양이 적어 질수록 배분 효율이 높아졌습니다.
현탁액의 세포에 대한 형질 검사를 수행하기 위해 2단계 프로토콜을 구현해야 했습니다. 경직세포에서 경전을 수행하였고 24시간 후에 분리되어 현탁액으로 도금되었습니다.7일 후, 통제된 종양스피어는 GFP를 발현하고 있었다. 종양스피어가 얻어지고, 치료되고, 이식된 후에생체내에서 종양 성장에서 이러한 상이한 치료의 효과를 비교할 수 있다.
이 방법은 과학자가 약물 검열을 위한 기초를 설정하는 동시에 rhabdomyosarcomas의 기원의 세포의 정지서 질문에 대답할 수 있게 합니다.
