Rabdomiyosarkom, histolojik olarak doku morfolojisi ve miyojenik belirteçlerin ekspresyonu ile karakterize yumuşak doku sarkomlarının nadir bir formudur. Ancak, bu tümörlerin farklı alt tiplerinin varlığı ve oluşumuna katkıda bulunan uyaranların heterojenliği göz önüne alındığında, menşe hücresinin tanımlanması çok zor olmuştur. Burada farelerden taze hasat tümör dokularından başlayarak rabdomiyosarkomların menşe hücresinin tanımlanması için tekrarlanabilir ve güvenilir yöntemler tarif ve bu tetkik tümör küre oluşumu tetkik.
Tümörlü sferans formasyon uyruplamanın başlıca avantajları, tümör kaynaklı hücrelerde bulunduğu bilinen hücresel özelliklere dayanması ve spesifik hücre popülasyonunun genişlemesi ve zenginleşmesi için de kullanılabilmeözelliğidir. Ayrıca, küresel yapısı tümör ortamını taklit eder, böylece ilaç tarama çalışmaları olarak kullanılabilir. Bu yöntem, moleküler belirteçler hakkında önceden bilgi gerektirmediği, ancak kültür koşullarının optimizasyonu gerektirebileceği nden diğer tümör tipine uygulanma potansiyeline sahiptir.
Tümörküre oluşturmak için biraz zaman alabilir, Özellikle tümör içinde nadir bir hücre popülasyonu belirlemeye çalışıyorsanız. Bu nedenle, denemelerinizin sonuçlarını olumsuz etkileyebileceğinden, her gün alt kültür plakanıza bakmanız önerilemez. 37 santigrat derecede bir kuvözde beş mililitre izolasyon medyası olan 10 santimetrelik bir plakayı ısıtarak başlayın.
Tümör dokusunun 500 ila 1000 miligram ağırlığında ve tabağa yerleştirin. Tümör dokusu ile plaka steril bir kültür başlık getirmek ve bir jilet ile kıyma. Optimum sindirim için, kıyılmış parçaların boyutları düzgün olduğundan emin olun.
Kıyma lı doku ve hücre izolasyon ortamını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Plakayı dört mililitre daha ortamla yıkayın ve tüpün içine ekleyin. Tüpkolajenaz çözeltisi mililitre başına 700 adet ekleyin ve 1 1 / 2 saat boyunca 37 derece santigrat bir sallayarak su banyosunda kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez g doku aşağı spin. Pelet bozmadan supernatant Aspire, sonra ikinci sindirim çözeltisi 10 mililitre pelet resuspend ve 30 dakika daha sallayarak su banyosunda kuluçka. İkinci sindirimden sonra, pipet hücre süspansiyon yukarı ve aşağı ve 50 mililitrelik santrifüj tüp üzerinde 70 mikrometrelik naylon filtre ile geçmek.
Daha sonra filtreyi 10 mililitre hücre izolasyon ukalalığı ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 300 kez g'de dokuyu aşağı doğru döndürün. Supernatant aspire ve tümör hücreli media 20 mililitre pelet resuspend. Süspansiyonu 15 santimetrelik bir kültür plakasına aktarın ve hücreleri bir gecede 37 derecelik bir kuvöze yerleştirin.
Ertesi gün, hücre sağkalımını olumsuz etkileyebilecek enkaz ve ölü hücreleri kaldırmak için ortamı değiştirin. Bu noktada, hücre birleşimini değerlendirin ve hücrelerin kuvözde büyümesine izin verin % 90'a ulaşana kadar hücreleri her gün izleyin ve her iki günde bir ortamı değiştirin. Tümörküre türasyonu için, birden fazla geçit yoluyla hücre seçimi önlemek için Passage P1 veya P2 hücreleri kullanın.
Hücre çanasını PBS ile yıkayın ve üzerini ayırma solüsyonu ile kapatın. 5 ila 10 dakika boyunca kuvözde yerleştirin ve sonra bir brightfield mikroskop altında plaka bakarak müfreze onaylamak. Hücreler ayrıldıktan sonra, tabağa tümör hücresi ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonuna bir santrifüj tüpüne aktarın.
Hücreleri 5 dakika boyunca 300 kez g'de döndürün, süpernatant'ı çıkarın ve tümörsfer medyasındaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri yeniden askıya aldıktan sonra, Trypan mavisi kullanarak sayın ve hücre konsantrasyonu hesaplayın. 96-iyi bir düşük eki plaka hücrelerin uygun sayıda plaka ve deney sonuna kadar kuvöz hücreleri yerleştirin, ortam doldurma sürece plaka rahatsız etmemeye dikkat.
Deney tamamlandıktan sonra, bir brightfield mikroskobu altında veya Celigo yazılımı kullanarak tümör küreleri elle tanımlayın. Bu tetkik sonucunda tümör kürelerinin sayısı ve büyüklüğü değerlendirilebilir. Allogreft transplantasyonu için tümör küreleri hazırlamak için, belirli bir hücre tipi veya tedaviden elde edilen tüm tümör küreleri bir araya getirin.
Tümör kürelerini santrifüj edin ve süpernatantı bir milimetrelik pipetle dikkatlice çıkarın ve ardından 200 mikrolitrelik pipet, sonra 10 mililitre steril PBS ile yıkayın. Tümör kürelerini tekrar aşağı çevirin ve PBS'yi aspire edin. Tümörsfer peletinin üstüne bir mililitrelik hücre ayırma çözeltisine 500 mikrolitre ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede sallayarak su banyosunda kuluçkaya yatırın.
Her 10 dakikada bir sindirim ini kontrol edin. Tüm işlem 30 dakika kadar sürer. Sallayarak su banyosunda tümörkürenin sindirimi tek hücreli bir çözelti elde etmek için yeterli değilse, yukarı ve aşağı borulama yoluyla mekanik bozulma önerilmektedir.
Tümörküreler döndükten sonra istikrarlı bir pelet oluşturmaz, bu nedenle süpernatant bir mililitrelik pipet ve 200 mikrolitrelik pipetler ile dikkatle yapılmalıdır. Tek hücreli bir çözelti elde edildikten sonra, tümör hücreli ortam hacmi ekleyin ve 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez g aşağı spin. Bu santrifüjden sonra, sonraki tüm adımlar buz üzerinde yapılmalıdır.
Soğuk tümör hücre lisanındaki hücreleri yeniden askıya alın ve Trypan mavisi dışlama kullanarak canlı hücreleri sayın. Allogreft için uygun hücre sayısını belirleyin ve soğuk tümör hücreli media 50 mikrolitre seyreltin. Soğutmak için soğuk tümör hücreli ortama bir pipet ucu yerleştirin ve daha sonra soğuk ECM çözeltisi 50 mikrolitre almak ve hücrelerle tüp eklemek için kullanabilirsiniz, bu işlem sırasında buz Dan ECM tüp kaldırmak için emin olun.
Nakil kadar buz üzerinde hücreleri korumak ve buz üzerinde 29-gauge iğne ile kapaklı, 0.5 mililitrelik insülin şırınga yerleştirin. Farenin düzgün bir şekilde anestezi altında olduğunu doğruladıktan sonra, hayvanın sağ tarafını tıraş edin, hücre çözeltisini soğutulmuş şırınganın içine aspire edin ve hücreleri deri altına tıraş edilen bölgeye enjekte edin. Enjeksiyon doğru yapılırsa, deri altında gözle görülür bir yumru oluşacaktır.
Bu protokol, yumuşak doku sarkomu gelişiminden sorumlu nadir hücre popülasyonlarının belirlenmesi için güvenilir bir şekilde tümör küreleri oluşturmak için kullanılabilir. Bu sedanın temel bir parçası tümör küreleri ve hücre kümeleri arasında ayrımcılık, hangi açık morfolojik farklılıklar göstermektedir. İlgi proteininin tümör hücreleri üzerinde bir etkiyi tetiklediği optimal konsantrasyonu belirlemek için, proteinin aşağı akım hedeflerinin ifade düzeyini değerlendirmek gerekir.
Test edilen genlerin üçünde rekombinant protein tedavisine doza bağımlı bir yanıt saptandı ve biri vermedi. Etkili bir protokol oluşturmak için transfeksiyonun doğal tümör hücreleri üzerindeki etkileri analiz edildi;iki farklı miktarda reaktif test edildi ve verimlilik GFP muhabiri plazmid ile değerlendirildi. Daha düşük miktarda reaktif daha yüksek transfeksiyon verimliliği ile sonuçlandı.
Süspansiyondaki hücrelere transfeksiyon yapmak için iki aşamalı bir protokol uygulanması gerekiyordu. Transfeksiyon yapışık hücrelere yapıldı ve 24 saat sonra söküldü ler ve süspansiyona bünyeyle kaplandılar;yedi gün sonra kontrollü tümörküreler GFP ifade edildi. Tümör küreler elde edildikten, tedavi edildikten ve nakledildikten sonra bu farklı tedavinin in vivo tümör büyümesindeki etkisini karşılaştırmak mümkündür.
Bu yöntemler bilim adamlarının rabdomiyosarkomların kökeni hücresinin hala ayakta duran sorularını yanıtlamalarını sağlarken aynı zamanda uyuşturucu taramasıiçin de temel oluşturacaktır.
