横紋筋肉腫は、組織形態と筋形成マーカーの発現によって組織学的に特徴づけられる軟部肉腫の稀な形態である。しかし、これらの腫瘍の異なるサブタイプの存在とその形成に寄与する刺激の不均一性を考えると、起源の細胞の同定は非常に困難であった。ここでは、マウスから採取したばかりの腫瘍組織から始まる横紋肉腫の起源の細胞を同定するための再現性と信頼性の高い方法を説明し、このアッセイは腫瘍球形成アッセイである。
腫瘍球形成アッセイの主な利点は、腫瘍発生細胞に存在することが知られている細胞特性に依存し、特定の細胞集団の拡張および濃縮にも使用できることである。さらに、そのスフェロイド構造は腫瘍環境を模倣し、したがって、それらは薬物スクリーニング研究として使用することができる。この方法は、分子マーカーの事前知識を必要としないが、培養条件の最適化を必要とするため、他のタイプの腫瘍に適用される可能性がある。
腫瘍球は、特にあなたの腫瘍内のまれな細胞集団を同定しようとする場合、形成するのに時間がかかるかもしれません。したがって、サブカルチャープレートは実験の結果に悪影響を及ぼす可能性があるため、毎日サブカルチャープレートを見ることをお勧めしません。摂氏37度のインキュベーターに5ミリリットルの隔離媒体を備えた10センチメートルのプレートを温めることから始めます。
腫瘍組織の500〜1,000ミリグラムの重量を量り、プレートに入れる。腫瘍組織のプレートを無菌培養フードに持ち込み、カミソリの刃でミンチします。最適な消化のために、ひき肉のサイズが均一であることを確認してください。
細かく組織と細胞分離媒体を15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。別の4ミリリットルの媒体でプレートを洗い、それをチューブに加えます。1ミリリットルのコラゲターゼ溶液をチューブに加え、摂氏37度の揺れる水浴に1時間半インキュベートします。
インキュベーション後、室温で5分間、300回gで組織を回転させます。ペレットを破壊することなく上清を吸引し、その後、ペレットを2番目の消化液の10ミリリットルで再懸濁し、さらに30分間振る水浴中でインキュベートする。2回目の消化後、細胞懸濁液を上下にピペットし、50ミリリットル遠心管の70マイクロメートルナイロンフィルターを通過します。
その後、10ミリリットルの細胞分離培地でフィルターを洗浄し、300倍gの組織を5分間回転させます。上清を吸引し、20ミリリットルの腫瘍細胞培地でペレットを再懸濁する。懸濁液を15センチメートルの培養プレートに移し、細胞を一晩摂氏37度のインキュベーターに入れます。
翌日、細胞の生存に悪影響を及ぼす破片や死んだ細胞を除去するためにメディアを変更します。この時点で、細胞の合流を評価し、細胞が毎日90%に達するまで培養器で増殖させ、2日ごとに培地を変更します。腫瘍圏誘導では、複数の通路を通る細胞選択を避けるために、パッセージP1またはP2の細胞を使用する。
PBSで細胞皿を洗い、剥離液で覆います。インキュベーターに5〜10分間置き、明視野顕微鏡の下でプレートを見て剥離を確認します。細胞が剥離したら、腫瘍細胞培地をプレートに加え、細胞懸濁液を遠心分離管に移す。
細胞を300回gで5分間回転させ、上清を取り除き、腫瘍球培地中の細胞を再懸濁させる。細胞を再中断した後、トリパンブルーを使用してそれらを数え、細胞濃度を計算します。96ウェル低付着プレートに適切な数の細胞をプレートし、実験の終わりまで培養器に細胞を入れ、培地を補充しない限りプレートを乱さないよう注意します。
実験終了後、明視野顕微鏡下で腫瘍球を手動で同定するか、Celigoソフトウェアを使用します。腫瘍球の数と大きさは、このアッセイの結果として評価することができる。同種移植のために腫瘍球を準備するには、特定の細胞タイプまたは治療から得られたすべての腫瘍球を一緒に引っ張る。
腫瘍球を遠心分離し、1ミリメートルのピペットで上澄み物を慎重に取り除き、続いて200マイクロリットルのピペットを取り除き、10ミリリットルの無菌PBSで洗浄します。腫瘍球を再び回転させ、PBSを吸引する。腫瘍球ペレットの上に1ミリリットルの細胞剥離液に500マイクロリットルを加え、摂氏37度の揺れる水浴中の細胞をインキュベートする。
10分ごとに消化の進行を確認してください。全体のプロセスは30分かかる。揺れる水浴中の腫瘍球の消化が単細胞溶液を得るのに十分でない場合、ピペットの上下による機械的破壊が示唆される。
腫瘍球を回転させた後は安定したペレットを形成しませんので、上清を吸引することは、1ミリリットルのピペットと200マイクロリットルのピペットで慎重に行われるべきです。単細胞溶液が得られたら、腫瘍細胞培地の体積を加え、摂氏4度で5分間300倍gで回転させます。この遠心分離の後、すべての後続のステップは氷の上で行われなければなりません。
冷たい腫瘍細胞培地中の細胞を再中断し、トリパンブルー排除を使用して生細胞を数える。同種移植のための細胞の適切な数を決定し、冷たい腫瘍細胞媒体の50マイクロリットルでそれを希釈する。ピペットチップを冷たい腫瘍細胞培地に入れて冷却し、それを使用して50マイクロリットルの冷たいECM溶液を取り、細胞と一緒にチューブに加え、このプロセス中に氷からECMチューブを取り除かないようにします。
移植まで氷の上に細胞を維持し、氷の上に29ゲージの針でキャップされた0.5ミリリットルのインスリン注射器を置きます。マウスが適切に麻酔されていることを確認した後、動物の右側を剃り、冷却されたシリンジに細胞溶液を吸引し、剃った領域に皮下に細胞を注入する。射出が正しく行われると、皮膚の下に目に見えるバンプが形成されます。
このプロトコルは、軟部肉腫の発達を担う稀な細胞集団を同定するために、確実に腫瘍球を形成するために使用することができる。このアッセイの基本的な部分は、腫瘍球と細胞クラスターの間の差別であり、明確な形態学的差異を示す。関心のあるタンパク質が腫瘍細胞に対する影響を引き起こす最適濃度を決定するには、タンパク質の下流標的の発現レベルを評価する必要があります。
試験された遺伝子のうち3つは組換えタンパク質治療に対する用量依存的な反応を示し、1つは示さなかった。効率的なプロトコルを確立するために、固有の腫瘍細胞に対するトランスフェクションの効果を分析し、2種類の異なる量の試薬を試験し、GFPレポータープラスミドで効率を評価した。試薬の量が少ないほどトランスフェクション効率が高くなりました。
懸濁液中の細胞にトランスフェクションを行うためには、2段階のプロトコルを実装する必要がありました。トランスフェクションは付着細胞に対して行われ、24時間後に剥離して懸濁液でメッキされた。7日後、制御された腫瘍球はGFPを発現していた。腫瘍球が得られた後、治療し、移植した後、生体内での腫瘍増殖におけるこの異なる治療の効果を比較することができる。
これらの方法は、科学者が薬物スクリーニングの基礎を設定すると同時に、横紋肉腫の起源の細胞の静止した質問に答えることを可能にする。
