Rabdomiossarcoma é uma forma rara de sarcomas de tecido mole caracterizada histologicamente pela morfologia tecidual e pela expressão de marcadores miogênicos. No entanto, dada a existência de diferentes subtipos desses tumores e a heterogeneidade dos estímulos que contribuem para sua formação, a identificação da célula de origem tem sido muito desafiadora. Aqui descrevemos métodos reprodutíveis e confiáveis para a identificação da célula de origem dos rabdomiossarcomas a partir da colheita recente de tecidos tumorais de camundongos e este ensaio é o ensaio de formação tumorais.
As principais vantagens do ensaio de formação tumorais é que ele se baseia em propriedades celulares que são conhecidas por estarem presentes em células originárias de tumores e também pode ser usada para expansão e enriquecimento da população celular específica. Além disso, sua estrutura esferoide imita o ambiente tumoral, podendo ser usados como estudos de rastreamento de drogas. Este método tem o potencial de ser aplicado a outros tipos de tumores porque não requer conhecimento prévio de marcadores moleculares, mas pode exigir otimização das condições culturais.
Tumores podem levar algum tempo para se formar, especialmente se tentar identificar uma população de células raras dentro do seu tumor. Assim, não é sugerido olhar para a sua placa de subcultura todos os dias, uma vez que pode afetar negativamente os resultados de seus experimentos. Comece aquecendo uma placa de 10 centímetros com cinco mililitros de mídia de isolamento em uma incubadora a 37 graus Celsius.
Pesar de 500 a 1.000 miligramas do tecido tumoral e colocá-lo na placa. Leve a placa com o tecido tumoral para uma capa de cultura estéril e pique-a com uma lâmina de barbear. Para uma digestão ideal, certifique-se de que os tamanhos das peças picadas são uniformes.
Transfira o tecido picado e a mídia de isolamento celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Lave a placa com mais quatro mililitros de mídia e adicione isso ao tubo. Adicione 700 unidades por mililitro de solução de colagenase ao tubo e incuba-o em um banho de água tremendo a 37 graus Celsius por 1 1/2 horas.
Após a incubação, gire o tecido a 300 vezes g durante cinco minutos em temperatura ambiente. Aspire o supernasce sem interromper a pelota, depois resuspenda a pelota em 10 mililitros de segunda solução de digestão e incubar no banho de água agitada por mais 30 minutos. Após a segunda digestão, pipete a suspensão celular para cima e para baixo e passe-a através de um filtro de nylon de 70 micrômetros em um tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Em seguida, lave o filtro com 10 mililitros de mídia de isolamento celular e gire o tecido a 300 vezes g por cinco minutos. Aspire o supernasal e resuspenda a pelota em 20 mililitros de mídia celular tumoral. Transfira a suspensão para uma placa de cultura de 15 centímetros e coloque as células em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, mude a mídia para remover detritos e células mortas que possam influenciar negativamente a sobrevivência celular. Neste ponto, avalie a confluência celular e permita que as células cresçam na incubadora até atingir 90% Monitorar as células todos os dias e mudar a mídia a cada dois dias. Para derivação tumorsphere, use células na Passagem P1 ou P2 para evitar a seleção celular através de múltiplas passagens.
Lave o prato da célula com PBS e cubra-os com solução de desprendimento. Coloque-os na incubadora por cinco a 10 minutos e, em seguida, confirme o desprendimento olhando para a placa sob um microscópio de campo brilhante. Uma vez que as células se despeçam, adicione a mídia celular tumoral à placa e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga.
Gire as células a 300 vezes g por cinco minutos, remova o supernaspe e resuspense as células na mídia tumorosa. Depois de reutilizar as células, conte-as usando azul Trypan e calcule a concentração celular. Emplaque o número adequado de células em uma placa de 96 poços de baixa fixação e coloque as células na incubadora até o final do experimento, tomando cuidado para não perturbar a placa a menos que reponha a mídia.
Após a conclusão do experimento, identifique tumores manualmente sob um microscópio de campo brilhante ou usando o software Celigo. O número e o tamanho das tumores podem ser avaliados como resultado deste ensaio. Para preparar tumores para transplante de aoenxerto, recomponha todas as tumores obtidas a partir de um tipo ou tratamento celular específico.
Centrifugar os tumores e remover cuidadosamente o supernascer com uma pipeta de um milímetro seguido de uma pipeta de 200 microliteres, em seguida, lavá-los com 10 mililitros de PBS estéril. Gire os tumores novamente e aspire o PBS. Adicione 500 microliters a um mililitro de solução de descolamento celular em cima da pelota tumorsphere e incuba as células em um banho de água tremendo a 37 graus Celsius.
Verifique a progressão da digestão a cada 10 minutos. Todo o processo leva até 30 minutos. Se a digestão da tumorfera no banho de água agitada não for suficiente para obter uma solução unicelular, sugere-se uma interrupção mecânica através da tubulação para cima e para baixo.
Note que depois de girar as tumorferas não formam uma pelota estável, por isso aspirar o supernante deve ser feito cuidadosamente com uma pipeta de um mililitro e pipetas de 200 microliteres. Uma vez que uma solução unicelular é obtida, adicione um volume de mídia celular tumoral e gire-a a 300 vezes g por cinco minutos a 4 graus Celsius. Após essa centrifugação, todas as etapas subsequentes devem ser realizadas no gelo.
Resuspend as células em mídia de células tumorais frias e conte células vivas usando a exclusão azul trypan. Determine o número adequado de células para o aoenerto e dilui-o em 50 microliters de mídia de células tumorais frias. Coloque uma ponta de pipeta na mídia celular tumoral fria para esfriá-la e, em seguida, use-a para pegar 50 microliters de solução ECM fria e adicioná-la ao tubo com células, certificando-se de não remover o tubo ECM do gelo durante este processo.
Mantenha as células no gelo até o transplante e coloque uma seringa de insulina de 0,5 mililitro com uma agulha de calibre 29 no gelo. Depois de confirmar que o camundongo foi devidamente anestesiado, raspe o lado direito do animal, aspire a solução celular na seringa resfriada e injete as células subcutânea na área raspada. Se a injeção for realizada corretamente, uma colisão visível se formará sob a pele.
Este protocolo pode ser usado para formar tumores de forma confiável para identificação de populações de células raras que são responsáveis pelo desenvolvimento de sarcoma de tecido mole. Uma parte fundamental deste ensaio é a discriminação entre tumores e aglomerados celulares, que apresentam diferenças morfológicas claras. Para determinar a concentração ideal na qual uma proteína de interesse desencadeia um efeito sobre as células tumorais, é necessário avaliar o nível de expressão dos alvos a jusante da proteína.
Três dos genes testados mostraram uma resposta dependente de dose ao tratamento de proteína recombinante e um não. Para estabelecer um protocolo eficiente, foram analisados os efeitos da transfecção em células tumorais inerentes;duas quantidades diferentes de reagente foram testadas e a eficiência foi avaliada com um plasmídeo GFP-reporter. Quantidades menores de reagente resultaram em maior eficiência de transfecção.
Um protocolo de duas etapas teve que ser implementado para realizar a transfecção em células em suspensão. A transfecção foi realizada em células aderentes e 24 horas depois foram separadas e emplacaram-se; após sete dias, tumores controlados estavam expressando GFP. Após a obtenção de tumores, tratados e transplantados é possível comparar o efeito desse tratamento diferente no crescimento do tumor in vivo.
Esses métodos permitirão que os cientistas respondam às questões ainda permanentes da célula de origem dos rabdomiossarcomas e, ao mesmo tempo, estabelecem a base para a triagem de drogas.
