elektronik chiming Makrofajlar kendi kendine kökenli olmayan molekülleri tespit konusunda uzmanolduğundan, transfect özellikle zordur. Plazmidler gibi DNA şablonlarından oluşturulan mRNA ile primer makrofajların yüksek verimli transfeksiyonuna olanak tanıyan bir protokolü tanımlıyoruz. Yöntemimizin en büyük avantajı, tespit edilebilir sitotoksisite veya immünojenite yokluğunda yüksek transfeksiyon oranlarının elde edilebilmiş olmasıdır.
Prosedürü gösteren Marc Herb benim laboratuvarımdan bir postdoc olacak. RNA transkripsiyon kitinin tüm bileşenlerini eriterek başlayın. Girdap reaktifler beş saniye ve 2,000 kez g iki saniye için aşağı spin, sonra kullanıma kadar buz üzerinde tutmak.
El yazması yönlere göre 0,5 mikrolitrelik mikrosantrifüj tüp içinde in vitro RNA transkripsiyon reaksiyonu hazırlayın. Tüpü girve aşağı çevir. Daha sonra 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatarak 400 rpm'de termal mikserde karıştırın.
Kuluçkadan sonra, doğrudan reaksiyon karışımıiçine DNase I iki mikrolitre ekleyin. Girdap ve tüp aşağı spin ve başka bir 15 dakika daha termal karıştırıcı içinde kuluçka. Kontrol jeli için Dnase ile işlenmiş ürünün iki mikrolitrelik bir aliquot'u rezerve edin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.
PolyA atıkları için, Dnase ile tedavi edilen reaksiyona beş mikrolitre 10X poliA polimeraz reaksiyon tamponu ve beş mikrolitre poliA polimeraz ekleyin. Girdap ve karışımı aşağı spin. Sonra 30 dakika boyunca termal mikserde kuluçkaya yatırın.
Reaksiyon tamamlandığında, kontrol jeli için iki mikrolitrelik bir aliquot alın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. 5-prime dephosphorilasyon reaktiflerini el yazması yönergelere göre doğrudan polyA kuyruklu ürüne ekleyin. Girdap ve tüp aşağı spin ve başka bir 30 dakika daha termal karıştırıcı içinde kuluçka.
Antarktika fosfatazını ısıtmak için 80 santigrat derecede iki dakikalık bir kuluçka ile defosforilasyon reaksiyonunu takip edin. Daha sonra özel bir RNA arıtma kiti kullanarak in vitro transkripsiyonu mRNA arındırın. Bir mikro hacim spektrofotometre ile eluted mRNA konsantrasyonu ve saflığını ölçün.
Tek bir ürünün varlığını doğrulamak için daha önce toplanan aliquots ile bir denaturing agarose jel çalıştırın, doğru transkript uzunluğu, ve poliA atık. MRNA transfeksiyon arabelleği hacimleri eksi mRNA transfeksiyon reaktifi ve mRNA hacimlerini bir reaksiyon tüpüne ekleyerek transfeksiyona hazırlanın. mRNA stoğunu eritin ve tüpü çevirerek hafifçe karıştırın.
Daha sonra reaksiyon tüpüne önceden hesaplanmış mRNA hacmini ekleyin. Girdap ve reaksiyon karışımı ve mRNA transfeksiyon reaktifaşağı spin, sonra reaksiyon karışımı tüp için mRNA transfeksiyon reaktif uygun hacmi ekleyin. Tüpü girve aşağı çevir.
Sonra 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Bu arada, taze sıcak kültür ortamı ile makrofajlar kültür ortamı değiştirin. Transfeksiyon karışımının kuluçkası tamamlandıktan sonra, karışımı makrofajları içeren plaka kuyularına ekleyin ve dışarıdan kuyunun ortasına doğru bir daire çizin.
Transfeksiyon karışımının düzgün dağılımını sağlamak için plakayı dikey ve yatay yönde hafifçe sallayın. Sonra en az altı saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit plaka kuluçka. Kuluçkadan sonra transfeksiyon verimliliğini floresan mikroskop, akış sitometrisi veya immünoblot ile analiz edin.
Bu işlemin en önemli kısmı transfeksiyon karışımının tek tip dağılımını sağlamaktır, böylece tüm makrofajlar aynı miktarda mRNA ile temas eder. Bu protokol, birincil makrofajların transfeksiyonu için FLAG etiketli NEMO ve IKK-beta türevlerini kodlamak için başarıyla kullanılmıştır. MRNA'nın doğru boyutu ve poliA takibi agarose jel elektroforezi ile doğrulandı.
Transfeksiyon verimliliği, mRNA kodlama GFP'si üretilmesi ve akış sitometri analizi nin gerçekleştirilmesi ile doğrulandı. Transfeksiyon oranı transfected mRNA miktarı ile birlikte artarak PM için %50-65 ve BMDM için %80-85'e ulaştı. Hem PM hem de BMDM'de transfected hücrelerde EGFP ekspresyonu düzeyi zaman ve doza bağlı bir şekilde artmıştır.
Daha da önemlisi, propidium iyodür-pozitif veya Annexin V-pozitif makrofajların analizi transfeksiyon prosedürünün litik veya apoptotik hücre ölümüne neden olmadığını doğrulamıştır. FLAG etiketli Nemo veya IKK-beta varyantlarını kodlayan mRNA'ların transfeksiyon etkinliği immünoforeskans mikroskobu ile analiz edildi. Bu oranlar Nemo mRNA'larda %60, IKK-beta mRNA'larda ise %55 idi.
Bu protokol aynı zamanda mRNA kodlama Cre recombinaz oluşturmak için kullanılmıştır. 400, 000 BMDM'nin 400 nanogram Cre rekombinaz mRNA ile transfeksiyonu, 48 saat sonra Nemo proteininin neredeyse tamamen tükenmesiyle sonuçlandı ve bu da yüksek verimli transfeksiyonu gösteriyordu. İnleökin 1 beta, Interlökin-6 ve tümör nekroz faktöründe saptanabilir miktarda olmaması transfeksiyon prosedürünün pro-inflamatuar sinyali aktive etmediğini göstermektedir.
Bizim nispeten basit yöntem nihayet verimli birincil makrofajlar mutasyona uğramış veya etiketli proteinlerin ifade sağlar. Bu, moleküler düzeyde makrofaj fonksiyonlarının analizini önemli ölçüde daha da ileriye taşıyacağıgibi.
