chiming eletrônico Porque macrófagos se especializam em detectar moléculas de não-auto-origem, eles são particularmente difíceis de transfectar. Descrevemos um protocolo que permite transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA gerado a partir de modelos de DNA, como plasmídeos. A principal vantagem do nosso método é que altas taxas de transfecção são alcançadas na ausência de qualquer citotoxicidade detectável ou imunogenicidade.
Demonstrando o procedimento será Marc Herb um pós-doutor do meu laboratório. Comece descongelando todos os componentes do kit de transcrição do RNA. Vórtice os reagentes por cinco segundos e gire-os por dois segundos a 2.000 vezes g, em seguida, mantê-los no gelo até usar.
Prepare a reação de transcrição in vitro do RNA em um tubo de microcentrífuga de 0,5 microliter de acordo com as instruções do manuscrito. Vórtice do tubo e gire-o para baixo. Em seguida, incuba-lo a 37 graus Celsius por 30 minutos enquanto mistura a 400 rpm em uma batedeira térmica.
Após a incubação, adicione dois microliters de DNase I diretamente na mistura de reação. Vórtice e gire o tubo para baixo, e incuba-o na batedeira térmica por mais 15 minutos. Reserve uma alíquota de dois microliter do produto tratado com Dnase para o gel de controle e armazene-o a menos 80 graus Celsius.
Para o rejeito de polia, adicione cinco microliters de tampão de reação de polimerase polimerase de 10X e cinco microliters de polimerase polia à reação tratada com Dnase. Vórtice e gire a mistura. Em seguida, incuba-lo na batedeira térmica por 30 minutos.
Quando a reação estiver completa, pegue uma alíquota de dois microliter para o gel de controle e armazene-a a menos 80 graus Celsius. Adicione reagentes de desfosforilação 5-prime diretamente ao produto de cauda polyA de acordo com as instruções do manuscrito. Vórtice e gire o tubo e incuba-o na batedeira térmica por mais 30 minutos.
Siga a reação de desfosforilação com uma incubação de dois minutos a 80 graus Celsius, a fim de inativar a fosfatase antártica. Em seguida, purifique o mRNA transcrito in vitro usando um kit de purificação de RNA dedicado. Meça a concentração e a pureza do mRNA elucido com um espectrofotômetro microvolume.
Execute um gel de agarose desnaturing com as alíquotas coletadas anteriormente para verificar a presença de um único produto, comprimento correto da transcrição e seguimento poliA. Prepare-se para a transfecção adicionando o volume pré-calculado do tampão de transfecção mRNA menos os volumes do reagente de transfecção mRNA e do mRNA a um tubo de reação. Descongele o caldo de mRNA e misture-o suavemente girando o tubo.
Em seguida, adicione o volume pré-calculado de mRNA ao tubo de reação. Vórtice e gire para baixo a mistura de reação e o reagente de transfecção mRNA, em seguida, adicione o volume apropriado do reagente de transfecção mRNA ao tubo de mistura de reação. Vórtice do tubo e gire-o para baixo.
Em seguida, incuba-lo em temperatura ambiente por 15 minutos. Enquanto isso, substitua o meio cultural dos macrófagos por um meio de cultura quente fresco. Uma vez que a incubação da mistura de transfecção esteja completa, adicione a mistura aos poços de placa contendo os macrófagos dropwise e em um círculo do lado de fora para o meio do poço.
Para garantir a distribuição uniforme da mistura de transfecção, balance suavemente a placa em uma direção vertical e horizontal. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos seis horas. Após a incubação, analise a eficiência de transfecção com microscopia de fluorescência, citometria de fluxo ou imunoblot.
A parte mais importante deste procedimento é garantir a distribuição uniforme da mistura de transfecção para que todos os macrófagos entrem em contato com a mesma quantidade de mRNA. Este protocolo foi usado com sucesso para gerar variantes NEMO e IKK-beta marcadas pelo MRNA para transfecção de macrófagos primários. O tamanho correto e o seguimento poliA do mRNA foram verificados por eletroforese de gel agarose.
A eficiência da transfecção foi confirmada pela geração de GFP de codificação de mRNA e pela realização da análise da citometria de fluxo. A taxa de transfecção aumentou junto com a quantidade de mRNA transfeccionado, atingindo 50 a 65% para PM e 80 a 85% para BMDM. Tanto na PM quanto no BMDM, o nível de expressão do EGFP em células transfeinadas aumentou de forma dependente de tempo e dose.
É importante ressaltar que a análise dos macrófagos propidium iodida-positivo ou anexo V-positivo confirmou que o procedimento de transfecção não induziu morte celular lístida ou apoptótica. A eficiência de transfecção das variantes nemo ou IKK-beta marcadas por MTS foram analisadas com microscopia de imunofluorescência. As taxas foram de cerca de 60% para Nemo mRNAs e 55% para iKK-beta mRNAs.
Este protocolo também foi usado para gerar mRNA codificando Cre recombinase. Transfecção de 400.000 BMDM com 400 nanogramas de Cre recombinase mRNA resultou em esgotamento quase completo da proteína Nemo após 48 horas, indicando transfecção altamente eficiente. A ausência de quantidades detectáveis de Interleucina 1 beta, Interleucina-6 e fator de necrose tumoral indicam que o procedimento de transfecção não ativa sinalização pró-inflamatória.
Nosso método relativamente simples finalmente permite expressar eficientemente proteínas mutadas ou marcadas em macrófagos primários. Isso aprofundaria substancialmente a análise das funções do macrófago no nível molecular.
