electrónicaMente porque los macrófagos se especializan en detectar moléculas de origen no propio, son particularmente difíciles de transfeccionar. Describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm generados a partir de plantillas de ADN como plásmidos. La principal ventaja de nuestro método es que se alcanzan altas tasas de transfección en ausencia de cualquier citotoxicidad o inmunogenicidad detectable.
Demostrando el procedimiento estará Marc Herb un postdoctorado de mi laboratorio. Comience descongelando todos los componentes del kit de transcripción de ARN. Vórtice los reactivos durante cinco segundos y gire hacia abajo durante dos segundos a 2.000 veces g, luego manténgalos sobre hielo hasta su uso.
Preparar la reacción de transcripción de ARN in vitro en un tubo de microcentrífuga de 0,5 microlitros de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Haz un vórtice en el tubo y gírla hacia abajo. Luego incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos mientras se mezcla a 400 rpm en un mezclador térmico.
Después de la incubación, añadir dos microlitros de DNase I directamente en la mezcla de reacción. Vórtice y gire el tubo hacia abajo, e incubarlo en la mezcladora térmica durante otros 15 minutos. Reserve una alícuota de dos microlitrotros del producto tratado con Dnase para el gel de control y guárdelo a menos 80 grados centígrados.
Para el cola polyA, agregue cinco microlitros de tampón de reacción de poliasa poliasa 10X y cinco microlitros de polialasa polialasa a la reacción tratada con Adn. Vórtice y gire hacia abajo la mezcla. A continuación, incubarlo en la mezcladora térmica durante 30 minutos.
Una vez completada la reacción, tome una alícuota de dos microlitrotro para el gel de control y guárdela a menos 80 grados centígrados. Añadir reactivos de desfosforilación de 5 primos directamente al producto de cola polyA de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Vórtice y gire hacia abajo el tubo, e incubarlo en la mezcladora térmica durante otros 30 minutos.
Siga la reacción de defosforilación con una incubación de dos minutos a 80 grados celsius para calentar la fosfatasa antártica. A continuación, purifique el ARNm transcrito in vitro utilizando un kit de purificación de ARN dedicado. Mida la concentración y pureza del ARNm eluido con un espectrofotómetro de microvolumen.
Ejecute un gel de agarosa desnaturalizado con las alícuotas previamente recogidas para verificar la presencia de un solo producto, la longitud correcta de la transcripción y el relación de poliA. Prepárese para la transfección añadiendo el volumen precalculado del tampón de transfección de ARNm menos los volúmenes de reactivo de transfección de ARNm y el ARNm a un tubo de reacción. Descongele el caldo de ARNm y mezcle suavemente volteando el tubo.
A continuación, añada el volumen precalculado de ARNm al tubo de reacción. Vórtice y gire hacia abajo la mezcla de reacción y el reactivo de transfección de ARNm, luego agregue el volumen adecuado del reactivo de transfección de ARNm al tubo de mezcla de reacción. Haz un vórtice en el tubo y gírla hacia abajo.
Luego incubarlo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mientras tanto, reemplace el medio de cultivo de los macrófagos por un medio de cultivo fresco y cálido. Una vez completada la incubación de la mezcla de transfección, añadir la mezcla a los pocillos de placa que contienen los macrófagos por gota y en un círculo desde el exterior hasta el centro del pozo.
Para asegurar una distribución uniforme de la transfección, mezcle suavemente la placa en una dirección vertical y horizontal. Luego incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante al menos seis horas. Después de la incubación, analice la eficiencia de la transfección con microscopía de fluorescencia, citometría de flujo o inmunoblot.
La parte más importante de este procedimiento es asegurar una distribución uniforme de la mezcla de transfección para que todos los macrófagos entren en contacto con la misma cantidad de ARNm. Este protocolo se utilizó con éxito para generar variantes NEMO e IKK-beta con etiquetas de ARNm con etiquetas DE ARNm para la transfección de macrófagos primarios. El tamaño correcto y el seguimiento de poliA del ARNm se verificaron mediante electroforesis de gel de agarosa.
La eficiencia de la transfección se confirmó generando la codificación de ARNm GFP y realizando análisis de citometría de flujo. La tasa de transfección aumentó junto con la cantidad de ARNm trans infectado, llegando a 50 a 65% para PM y 80 a 85% para BMDM. Tanto en PM como en BMDM, el nivel de expresión de EGFP en las células trans infectadas aumentó en un tiempo y dependiente de la dosis.
Es importante destacar que el análisis de los macrófagos propidium yoduro positivos o Annexin V positivo confirmó que el procedimiento de transfección no indujo la muerte celular lítica o apoptótica. La eficiencia de la transfección de los mRNAs que codifican las variantes Nemo o IKK-beta con flagrante se analizó con microscopía de inmunofluorescencia. Las tasas fueron de alrededor del 60% para nemo mRNAs y del 55% para los MRNAs IKK-beta.
Este protocolo también se utilizó para generar la codificación de ARNm Cre recombinase. La transfección de 400.000 DDM con 400 nanogramos de ARNm recombinasa de Cre dio lugar a un agotamiento casi completo de la proteína Nemo después de 48 horas, lo que indica una transfección altamente eficiente. La ausencia de cantidades detectables de Interleucina 1 beta, Interleucina-6 y factor de necrosis tumoral indica que el procedimiento de transfección no activa la señalización proinflamatoria.
Nuestro método relativamente simple finalmente permite expresar eficientemente proteínas mutadas o etiquetadas en macrófagos primarios. Esto aumentaría sustancialmente el análisis de las funciones de los macrófagos a nivel molecular.
