פעמונים אלקטרוניים מכיוון שמאקרופאגים מתמחים בזיהוי מולקולות ממקור לא עצמי, קשה במיוחד לשנות אותן. אנו מתארים פרוטוקול המאפשר החלפה יעילה ביותר של מקרופאגים ראשוניים עם mRNA שנוצר מתבניות DNA כגון פלסמידים. היתרון העיקרי של השיטה שלנו הוא כי שיעורי transfection גבוהים מושגים בהיעדר כל cytotoxicity לזיהוי או אימונוגניות.
הדגמת ההליך תהיה מארק הרב פוסט-דוק מהמעבדה שלי. התחל על ידי הפשרת כל הרכיבים של ערכת שעתוק RNA. Vortex reagents במשך חמש שניות ולסובב אותם למטה במשך שתי שניות ב 2, 000 פעמים g, ואז לשמור אותם על קרח עד השימוש.
הכן את תגובת שעתוק RNA במבחנה בצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 מיקרוליטר בהתאם לכיווני כתב היד. מערבולת הצינור ולסובב אותו. ואז להדק אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות תוך ערבוב ב 400 סל"ד על מערבל תרמי.
לאחר הדגירה, להוסיף שני microliters של DNase אני ישירות לתוך תערובת התגובה. מערבולת ולסובב את הצינור למטה, ולהדרור אותו במיקסר התרמי במשך 15 דקות נוספות. שמרו על אליקוט שני מיקרוליטר של המוצר שטופל בדנ"א לג'ל הבקרה ואחסנו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.
לזנב פוליA, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של חיץ תגובת פולימראז פולימראז 10X וחמישה מיקרוליטרים של פולימראז פוליA לתגובה שטופלה בדנ"א. מערבולת ולסובב את התערובת. ואז להדרגר אותו במיקסר התרמי במשך 30 דקות.
כאשר התגובה הושלמה, לקחת aliquot שני microliter עבור ג'ל הבקרה ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. הוסף 5-reagents dephosphorylation 5-פריים ישירות למוצר זנב polyA על פי הוראות כתב היד. מערבולת ולסובב במורד הצינור, ולהדרגר אותו במיקסר התרמי במשך 30 דקות נוספות.
בצע את תגובת dephosphorylation עם דגירה של שתי דקות ב 80 מעלות צלזיוס על מנת לחמם לנטרל את הפוספטזה האנטארקטית. לאחר מכן לטהר את mRNA מועתק במבחנה באמצעות ערכת טיהור RNA ייעודית. למדוד את הריכוז והטוהר של mRNA אלוט עם ספקטרופוטומטר microvolume.
הפעל ג'ל אגרוז denaturing עם aliquots שנאספו בעבר כדי לאמת את נוכחותו של מוצר יחיד, אורך תעתיק נכון, וזנב polyA. היכונו לתרגום רוחבי על-ידי הוספת אמצעי האחסון המחושב מראש של מאגר ההמרה mRNA פחות אמצעי האחסון של ריאגנט ה-mRNA וה-mRNA לצינור תגובה. מפשירים את מלאי ה-mRNA ומערבבים אותו בעדינות על ידי היפוך הצינור.
לאחר מכן הוסיפו את הנפח המחושב מראש של mRNA לצינור התגובה. Vortex ולסובב את תערובת התגובה ואת ריאגנט transfection mRNA, ולאחר מכן להוסיף את הנפח המתאים של ריאגנט transfection mRNA לצינור תערובת התגובה. מערבולת הצינור ולסובב אותו.
ואז לה הדגירה אותו בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. בינתיים, החלף את מדיום התרבות של המקרופאגים במדיום תרבות חם ורענן. לאחר הדגירה של תערובת transfection הושלמה, מוסיפים את התערובת לפלטות המכילות את המקרופאגים dropwise ובעיגול מבחוץ לאמצע הבאר.
כדי להבטיח חלוקה אחידה של transfection לערבב בעדינות רוק הצלחת בכיוון אנכי ואופקי. ואז לה הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני לפחות שש שעות. לאחר הדגירה, לנתח יעילות transfection עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ציטומטריה זרימה או immunoblot.
החלק החשוב ביותר של הליך זה הוא להבטיח הפצה אחידה של תערובת transfection כך שכל המקרופאגים ליצור קשר עם אותה כמות של mRNA. פרוטוקול זה שימש בהצלחה ליצירת גרסאות NEMO ו- IKK-beta עם קידוד mRNA עבור חילוף של מקרופאגים ראשיים. גודל נכון וזנב polyA של mRNA אומת על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose.
יעילות Transfection אושרה על ידי יצירת mRNA קידוד GFP וביצוע ניתוח ציטומטריה זרימה. שיעור ההדבקה גדל יחד עם כמות mRNA מנופל, והגיע 50 עד 65% עבור PM ו 80 עד 85% עבור BMDM. הן PM והן BMDM, רמת הביטוי של EGFP בתאים מומרים גדלה בזמן ובאופן תלוי מינון.
חשוב לציין, ניתוח של propidium יודיד חיובי או נספח V חיובי מקרופאגים אישרו כי הליך transfection לא לגרום למות תאים ליטיק או apoptotic. יעילות Transfection של mRNAs קידוד גרסאות נמו מתויגות בדגל או IKK-בטא נותחו עם מיקרוסקופיה immunofluorescence. התעריפים היו כ-60% עבור נמו mRNAs ו-55% עבור MRNAs של IKK-beta.
פרוטוקול זה שימש גם ליצירת קידוד mRNA Cre recombinase. Transfection של 400, 000 BMDM עם 400 ננוגרם של Cre recombinase mRNA הביא דלדול כמעט מוחלט של חלבון נמו לאחר 48 שעות, המציין transfection יעיל מאוד. היעדר כמויות ניתנות לגילוי של אינטרלוקין 1 בטא, אינטרלוקין-6 וגורם נמק הגידול מצביעים על כך שהליך ההשתנות אינו מפעיל איתות פרו דלקתי.
השיטה הפשוטה יחסית שלנו מאפשרת סוף סוף לבטא ביעילות חלבונים שעברו מוטציה או מתויגים במקרופאגים ראשוניים. זה יקדם באופן משמעותי את הניתוח של פונקציות מקרופאג ברמה המולקולרית.
