chiming elettronico Poiché i macrofagi sono specializzati nel rilevare molecole di origine non auto, sono particolarmente difficili da trasfezionere. Descriviamo un protocollo che consente una trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA generato da modelli di DNA come i plasmidi. Il vantaggio principale del nostro metodo è che alti tassi di trasfezione si ottengono in assenza di citotossicità o immunogenicità rilevabili.
A dimostrare la procedura sarà Marc Herb un postdoc del mio laboratorio. Inizia scongelando tutti i componenti del kit di trascrizione dell'RNA. Vortice i reagenti per cinque secondi e farli girare verso il basso per due secondi a 2.000 volte g, quindi tenerli sul ghiaccio fino all'uso.
Preparare la reazione di trascrizione dell'RNA in vitro in un tubo di microcentrifugo da 0,5 microliter secondo le indicazioni del manoscritto. Vortice il tubo e girarlo verso il basso. Quindi incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti durante la miscelazione a 400 giri/min su un miscelatore termico.
Dopo l'incubazione, aggiungere due microlitri di DNasi I direttamente nella miscela di reazione. Vortice e far girare il tubo verso il basso e incubarlo nel miscelatore termico per altri 15 minuti. Riservare un'aliquota a due microliter del prodotto trattato con Dnase per il gel di controllo e conservarlo a meno 80 gradi Celsius.
Per la coda poliA, aggiungere cinque microlitri di tampone di reazione della poliA polimerasi 10X e cinque microlitri di poliA polimerasi alla reazione trattata con Dnase. Vortice e spin down il mix. Quindi incubarlo nel miscelatore termico per 30 minuti.
Una volta completata la reazione, prendere un'aliquota a due microliter per il gel di controllo e conservarla a meno 80 gradi Celsius. Aggiungere reagenti di defosforilazione a 5 primi direttamente al prodotto coda poliA secondo le indicazioni del manoscritto. Vortice e girare lungo il tubo e incubarlo nel miscelatore termico per altri 30 minuti.
Seguire la reazione di defosforilazione con un'incubazione di due minuti a 80 gradi Celsius per inattivare termicamente la fosfatasi antartica. Quindi purificare l'mRNA trascritto in vitro utilizzando un kit di purificazione dell'RNA dedicato. Misurare la concentrazione e la purezza dell'mRNA eluitato con uno spettrofotometro a microvolume.
Eseguire un gel di agarosio denaturante con le aliquote raccolte in precedenza per verificare la presenza di un singolo prodotto, la corretta lunghezza della trascrizione e la coda in poliA. Prepararsi per la trasfezione aggiungendo il volume pre-calcolato del buffer di trasfezione dell'mRNA meno i volumi di reagente di trasfezione dell'mRNA e l'mRNA a un tubo di reazione. Scongelare il materiale mRNA e mescolarlo delicatamente capovolgendo il tubo.
Quindi aggiungere il volume pre-calcolato di mRNA al tubo di reazione. Vortice e spin verso il basso la miscela di reazione e il reagente di trasfezione dell'mRNA, quindi aggiungere il volume appropriato del reagente di trasfezione dell'mRNA al tubo di miscela di reazione. Vortice il tubo e girarlo verso il basso.
Quindi incubarlo a temperatura ambiente per 15 minuti. Nel frattempo, sostituire il mezzo di coltura dei macrofagi con un mezzo di coltura caldo fresco. Una volta completata l'incubazione della miscela di trasfezione, aggiungere il mix ai pozzali di piastra contenenti i macrofagi dropwise e in un cerchio dall'esterno al centro del pozzo.
Per garantire una distribuzione uniforme del mix di trasfezione scuotere delicatamente la piastra in direzione verticale e orizzontale. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per almeno sei ore. Dopo l'incubazione, analizzare l'efficienza di trasfezione con microscopia a fluorescenza, citometria del flusso o immunoblot.
La parte più importante di questa procedura è garantire una distribuzione uniforme della miscela di trasfezione in modo che tutti i macrofagi vengono a contatto con la stessa quantità di mRNA. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per generare varianti NEMO e IKK-beta con tag mRNA per la trasfezione dei macrofagi primari. Le dimensioni corrette e la coda in poliA dell'mRNA sono state verificate dall'elettroforesi del gel di agarosio.
L'efficienza della trasfezione è stata confermata generando la codifica dell'mRNA GFP ed eseguendo l'analisi della citometria del flusso. Il tasso di trasfezione è aumentato insieme alla quantità di mRNA trasfetto, raggiungendo il 50-65% per pm e l'80-85% per BMDM. Sia in PM che in BMDM, il livello di espressione di EGFP nelle cellule trasfette è aumentato in modo dipendente dal tempo e dalla dose.
È importante sottolineare che l'analisi dei macrofagi propidi-positivi allo ioduro o dell'allegato IV-positivo ha confermato che la procedura di trasfezione non ha provocato la morte cellulare litica o apoptotica. L'efficienza di trasfezione degli mRNA che codificano le varianti Nemo o IKK-beta con tag FLAG sono state analizzate con microscopia ad immunofluorescenza. Le tariffe erano di circa il 60% per gli mRNA Nemo e del 55% per gli MRNA IKK-beta.
Questo protocollo è stato utilizzato anche per generare la codifica mRNA Cre recombinase. La trasfezione di 400.000 BMDM con 400 nanogrammi di mRNA cre ricombinasi ha comportato un esaurimento quasi completo della proteina Nemo dopo 48 ore, indicando una trasfezione altamente efficiente. L'assenza di quantità rilevabili di Interleuchina 1 beta, Interleuchina-6 e fattore di necrosi tumorale indicano che la procedura di trasfezione non attiva la segnalazione pro-infiammatoria.
Il nostro metodo relativamente semplice consente infine di esprimere in modo efficiente proteine mutate o taggate nei macrofagi primari. Ciò promuoverebbe sostanzialmente l'analisi delle funzioni del macrofago a livello molecolare.
