通过胚胎移植，生成具有突变倍体肢体的奇美体轴球

该协议允许生产可用于轴球基因筛选的变异单倍体四肢。在单倍体中，即使是低层次的突变，也会产生细胞内功能表型的丧失。这种嫁接技术也可以用来拯救胚胎致命的表型。

这种方法可用于研究任何两栖动物的再生，这些两栖物种都可用于体外受精和嫁接。在使用单倍体胚胎作为捐赠者之前，我们建议练习并确认GP阳性和负二倍体胚胎之间的移植成功。对于女性游戏捐赠者的准备，麻醉性成熟的白色或白色RFP女性斧头作为游戏捐赠者。

在确认对疼痛模拟缺乏反应后，使用30量胰岛素注射器将0.15毫升的人类胆道性腺激素注射到后肢的肌肉背。将注射器以 45 度角插入中线，以避免与脊髓接触。将注射的动物放在新鲜的40%霍尔特弗雷特溶液中，将斧头转移到8至12摄氏度的冰箱中48小时。

然后将雌性返回到室温。当雌性正在产卵时，将一个完全麻醉的雄性放在湿纸巾的上部位置，放在解剖显微镜下，用占统治地位的手将P1000移液器的尖端放在基卡底部。将另一个食指和拇指放在骨盆两到三厘米的罗体，轻轻挤压动物，同时将手指向后腿移动，将收集每个样本的精子尿样冲洗到新的微离心管中。

然后将每个样品中的五微升转移到培养皿中，使用倒置显微镜检查精子的质量。计数后，在0.1X无菌MMR中将精子稀释至每毫升8倍至第四细胞的浓度，并每卵将0.5微升精子细胞转移到新的培养皿中。然后使用移液器尖端将悬浮液铺到一毫米厚的层，并使用塑料升降机将样品从 254 纳米交联器的灯泡中放置四厘米，以每毫米平方的 8 倍 10 到 5 微焦耳进行辐照。

收集健康的精子样本后，将雌性放在一叠湿纸巾上的苏平位置，并使用类似的冲洗运动从雌性斧头中提取未受精的卵子。然后用湿钳将鸡蛋转移到10厘米的培养皿中。在收集后15分钟内，使用P10移液器将辐照精子分配到未受精的卵子上，每个卵子上涂有0.25至0.5微升的灭活精子。

让鸡蛋在室温下坐30分钟后，用0.1XMMR将鸡蛋淹没。水化后30分钟，用锋利的钳子对鸡蛋进行解热，并在7小时内将鸡蛋放在18摄氏度的微注射中。要产生单倍体双倍体嵌合，将一个健康单倍体捐赠者与一个或两个阶段匹配的GP正双倍体宿主胚胎放在含有手术介质的预冷手术盘中的槽中，在10摄氏度或较低的冷却阶段。

使用两个超细的高压直头钳子去除整个肢体芽和周围的外皮和中皮组织层，并留出宿主组织。从单倍体捐赠者身上取出同等大小的组织护套，将单倍体供体组织护套放在宿主胚胎的相应区域。用从碎显微镜盖玻璃上用自动处理的矩形玻璃碎片固定组织，然后轻轻地将组织压入宿主胚胎体。

将锚留在位，每 20 分钟检查 60 到 75 分钟，以确认玻璃在使用钳子剥去盖玻璃碎片之前没有滑动。将移植的胚胎移植到新鲜的手术介质中，使其在8至12摄氏度下一夜之间痊愈，然后将植入的胚胎单独放在12或24孔的板中。38.7%的卵母细胞发育成正常发育的单倍体胚胎。

在移植阶段，单倍体胚胎沿前后轴显示曲线降低，蛋黄塞的外壳不完整。此外，荧光显微镜可用于确认单倍体胚胎没有亲子衍生的GP表达。失败和不纯的嫁接产生各种表型。

当移植物是清洁和正常发展，GFP表达应主要限于胸膜丛，神经网络派生自主机脊髓。Punctate GFP表达也存在于单个细胞中，这些细胞似乎是血液衍生宿主细胞中迁移到发育中的肢体的感官神经元。当使用 RFP 阳性捐赠者时，单倍体移植四肢表现出 RFP 的通用表达。

在整个发育过程中，非突变的单倍体四肢明显短于嵌合动物中相对的二倍体前肢。非突变的单倍体四肢完全再生，尽管与二倍体相比，它们在达到数字生长阶段方面略有延迟。记得使用无菌技术，完全去除和更换胚胎宿主中皮和外皮组织层，以产生一个干净的移植肢体。

突变的四肢可以截肢，并评分再生表型。突变等位基因可以用下一代测序进行量化。结合CRISPR-Cas9突变，我们的移植技术使我们能够在再生单倍体四肢时对靶向基因进行负选择筛选。