通过CAS9蛋白-gRNA复合物电穿孔直接基因敲除Axolotl脊髓神经干细胞

该协议允许快速和高度穿透时间和空间限制基因敲出轴脊髓神经干细胞的研究脊髓再生的分子机制。该技术允许研究神经干细胞中的基因功能，其医学再生，而不会被其他细胞类型的发育效应或效应所迷惑。Axolotl神经干细胞在很大程度上有助于它们再生脊髓的能力。

了解再生机制可以带来对开发人类脊髓损伤治疗的见解。这种方法提供了对轴托洛神经干细胞如何对脊髓损伤进行再生反应的洞察。正确定位注射毛细管到脊髓中央柱可能具有挑战性，在测试动物身上练习有助于掌握该技术。

查看管理可以显示如何执行注射，以及成功的注射是什么样子。为了准备Cas9导导RNA核蛋白混合物，混合5微克的Cas9核定位序列蛋白、4微克导导RNA和0.9微升10X Cas9缓冲液。然后将总体积与无核酶水一起带到 10 微升，如果不立即使用，则将 Cas9 导导 RNA 核蛋白混合物储存在零下 80 摄氏度。

对于阿加罗斯电穿孔板制备，在杜尔贝科的PBS中制备200毫升2%的加糖，并在微波炉中溶解混合物。稍稍冷却后，将液体气糖倒入10厘米培养皿中，深度约为10毫米，让板在室温下凝固。当阿加罗斯是坚定的触摸，使用手术手术刀切开一个缝在每道菜的阿加罗斯保持尾巴直，一口井，以适应动物的身体，和两个额外的井，以举行电极。

然后将盘子放在冰上，用冰冷的 DPBS 填充到边缘。要配置电穿孔器，请将孔隙脉冲设置为一个双极脉冲，持续时间为 70 伏，持续时间为 5 毫秒，间隔为 50 毫秒，且无电压衰减。将传输脉冲设置为四个 40 伏的双极脉冲，持续时间为 50 毫秒，间隔为 999 毫秒，电压衰减为 10%。

然后将电极连接到电穿孔器并调整钳子，使它们相距七毫米，然后再将电极淹没在 PBS 的烧杯中。要准备玻璃微喷射毛细管，请根据制造商的说明对微管拉拔器执行斜坡测试，以确定热值。然后用指示参数拉取带锥形末端的喷射毛细管。

拉后，使用立体显微镜和细钳以一定角度打破毛细管，使毛细管在尖端足够薄的位置倾斜，以瞄准轴椎的中央运河，同时保持足够强，足以刺穿皮肤。在加载尖端之前，以 1 比 30 的比例向核核蛋白混合物添加快速绿色 FCF 溶液，并使用凝胶加载移液器尖端将注射混合物的大约 5 微升加载到毛细管中。然后将毛细管安装在气动泵上，倾斜的尖端朝下。

要配置气动泵，请将保持设置为每平方英寸 0.5 磅，将弹射设置为每平方英寸保持 2 磅，将持续时间设置为门控。要测试毛细管和泵设置，请将毛细管浸入一滴水中，然后踩脚踏板进行注射。注射混合物应该在缓慢但稳定的流中出来。

要注入核蛋白混合物，请翻转要倒置在水中的斧头，以确认其反应，并使用环钳将一只动物转移到硅胶床上，动物的左侧朝上，尾巴指向右侧。将注射部位置于立体显微镜视野的中间，并调整微操纵器，使毛细管从视场右侧以 60 度角进入动物。识别脊髓和中央管后，缓慢地将毛细管移向脊髓中央管，直到它轻轻地刺穿皮肤和肌肉。

当毛细管就位时，按住脚踏板将混合物注入中央运河。如果毛细管被正确放置，核核蛋白混合物将沿着中央运河以蓝线向两个方向扩散。正确定位毛细管可能具有挑战性。

如果混合物未正确扩散，请按小步骤调整毛细管位置，同时保持脚垫。继续按住脚踏板，直到混合物到达脊髓和大脑心室的端囊。注射过程中可能需要调整喷射压力。

注射后，立即使用环钳将动物转移到冰上准备好的气糖电穿孔板上，将尾巴放在缝隙内，以便被加糖夹。将电极放入尾部两侧的孔中，注意整个动物和电极被冰冷的 PBS 覆盖，然后按脚开关开始电穿孔。然后将动物返回水中进行监测，直到完全恢复，并以这种方式注入和电毒随后的动物。

为了在蛋白质水平上评估淘汰的效率，获得尾部的横截面，并按照标准方案进行免疫组织化学分析。或者，提取电穿孔脊髓，并提取样品以获得DNA。然后执行基因分型PCR，然后进行桑格测序或下一代测序，以评估编辑的遗传位位百分比。

Cas9 引导 RNA 复合物对 Sox2 的注射和电穿孔导致大多数脊髓神经干细胞中 Sox2 免疫反应性大量丧失，相比之下，Cas9 引导 RNA 复合物的注射和电穿孔对酪氨酸酶进行控制。在脊髓组织部分样本中对Sox2阳性细胞进行定量分析，发现Cas9 Sox2中Sox2表达细胞的数量显著减少，引导RNA电穿孔敲出动物，表明这种方法导致脊髓神经干细胞中高效且高穿透性基因敲出。在同时注射和电穿孔两个Cas9引导RNA复合物对Sox2和GGFP到转基因阿索洛茨与无处不在的GP表达，观察到高百分比的双敲出神经干细胞，表明该协议可用于灵活敲出多个基因。

练习用毛细管定位中央运河，并放入配方与故障排除步骤，当注射不能正常工作时，这很有帮助。这项技术使研究人员能够研究神经干细胞中特有的再生基因的功能。操纵毛细管时小心，确保不要刺伤自己的手指。