该协议使我们能够调查药物释放支架在小动物模型的幼虫狭窄，使我们能够利用转基因动物在成本效益的方式。药物-止风气道支架的转口放置使动物从开放切口到气管，代表更临床相关的喉角狭窄模型。该技术有助于对治疗喉管狭窄的当地药物输送策略进行临床前研究。
该技术为小型动物模型药物-止风气道支架的转化研究提供了一个可行有效的平台，可应用于大型动物模型的未来研究以及临床应用。技术，特别是横部插管、气管损伤诱导、气道支架放置步骤。这种技术上具有挑战性的手术的视觉演示至关重要，因为许多细节无法用语言充分描述。
要制作含有聚合物溶液的 1%拉帕霉素，在玻璃瓶中加入 6 毫克拉帕霉素至 600 毫克 70-30 PLLA-PCL。在烟罩下，在拉帕霉素中加入六毫升二氯甲烷，补充和控制小瓶，并在每个小瓶中加入120微升甘油。然后盖住小瓶，让 PLLA-PCL 溶液在室温下均质6至12小时。
为了创建一个粘液气道支架，使用无菌材料和技术，在减缓导管旋转的同时，将一毫升拉帕霉素补充的PLLA-PCL溶液涂抹在22表氟乙烯丙烯的静脉导管上。应用所有溶液后，用血管导管的尖端朝下支撑模制血管导管，并在真空罩中的玻璃培养皿边缘支撑导管的螺旋。在室温下真空下 24 小时后，轻轻扭动和滑动干燥支架结构中的导管，并圆周检查支架中是否有在铸造过程中可能造成的任何缺陷。
为了帮助可视化，在支架的长度下画一条细黑线是有帮助的。用细直剪刀修剪铸造支架的每一端，使边缘轴向，并使用剪刀将每个支架切割成三毫米轴向段。然后将每个三毫米支架加载到新的 22 量轨静脉导管上。
对于喉角狭窄诱导，在确认对趾捏缺乏反应后，将第一只小鼠放在手术平台上，在中心切口周围将一小块线圈在平台顶部。用胶带将四肢固定到桌子上，并在鼠标颈部进行1.5厘米的中线垂直切口。分割覆盖胸腺，将两个所得叶横向化，以可视化气管。
将上部附件的上部胸腺和胸腺肌肉双边分割，并通过喉部转经 22 量表血管导管进入气管。使用小钳子，对小鼠的前部施加压力，以帮助正确放置导管。正确放置的血管导管可以通过气管以白色来可视化。
为了诱发伤害，请通过插入的血管导管通过布洛霉素涂层的钢丝刷，然后慢慢取走导管，使只有钢丝刷留在气管内。使用精细钳子，在气管上施加反压，用刷子机械地扰乱气管流明，然后再将导管重新插入刷上的气管。在插入和拆卸刷之前，再取出钢丝刷并重新应用 Bleomycin，就像刚才演示的一样。
在上次使用 Bleomcin 后，从气管中取出导管。对于 PLLA-PCL 的转口放置，请确保在每个支架中加入一条细黑色垂直线，并跨地插入鼠标与预加载血管导管。支架应通过转式切口在气管内可视化。
当支架就位时，使用细钳通过切口牢固而轻轻地抓住气管，将支架固定到位并拆下导管。尽可能小心地放置支架至关重要。气管压力太大会导致支架坍塌，导致气道阻塞，动物死亡。
用组织胶水或可吸收的4-0色缝合线关闭切口，让鼠标通过监测恢复，然后再将动物返回到其家庭笼子。在适当的实验终点点，将感兴趣的鼠标放在手术平台上的超端位置，并使用精细弯曲的虹膜剪刀重新打开切口。如所示，暴露气管，并使用剪刀将外气管分到支架水平以下。
接下来，将近侧气管分在喉部下方和支架上方，将分裂的气管与后食道分开。然后从气管上取下支架，将气管固定为10%正式素24小时。本研究中使用的可生物降解雷帕霉素加载 PLLA-PCL 支架结构能够在生理条件下以一致和可预测的方式使用拉帕霉素。
在此图像中，可以在气管内原位观察小型生物相容支架，如通过半透明小鼠气管可视化的支架上的黑色标记所示。21天后，黑色染料标记可用于确认气管内支架位置的维持。使用免疫荧光染色对急性和慢性炎症标志物进行生物相容性测试表明，PLLA-PCL支架结构不是由在无损伤的情况下放置后存在的最小数量的免疫细胞所决定的免疫反应。
以微妙和创伤的方式操纵气道对于手术的成功至关重要。过度的力、多重插管和支架坍塌可导致动物死亡。使用拉帕霉素-止动支架进行治疗后，可以通过定量实时PCR评估存活率、基因表达，进行包括流细胞学、ELISA和免疫细胞化学在内的免疫测定。
由于该技术为小鼠模型中的药物洗脱提供了一个成功的平台，因此为未来研究幼虫狭窄局部应用疗法铺平了道路。二氯甲烷是一种腐蚀性液体。请务必始终使用烟罩、个人防护设备和非腐蚀性材料
