该方案允许在不同的组织操作程序（例如去上皮化和气道组织再生）期间对分离的气道组织进行体外培养和直接显微镜可视化。本研究中提出的原位成像允许在成像引导下受控切除内源性上皮和外源性细胞递送期间快速无损地监测气管腔。成像引导的生物反应平台和组织操作方案可用于生成生物工程气道组织，用于疾病建模和药物筛选。
成像气道组织生物反应器的构建和使用将由我们研究小组的两名博士生Mohammad Mir和Jiawen Chen演示。要开始创建原位成像设备，请将镜筒透镜插入可堆叠透镜管中，并使用挡圈将其固定。然后，通过C接口适配器将镜头台组件安装到科学CMOS相机上。
使用Micromanager软件操作相机并获取照片和视频。在瞄准距离相机10米的物体时，调整管透镜与摄像机成像传感器之间的距离，直到在计算机屏幕上形成物体的聚焦图像。接下来，使用光学笼系统组件，如装配杆，螺纹笼板和笼式立方体，将滤光透镜安装在双刃，超分辨率，二向色镜和激光器上。
将20倍物镜连接到设备。然后，通过X-Y转换器在镜管的远端安装直径为500微米的绿色透镜。调整绿色和物镜之间的距离，形成聚焦的微观图像。
为了在明场或荧光中可视化分离的大鼠气管腔，将生物反应器放在成像台上。接下来，注入500微升新鲜制备的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯或CFSE溶液，流速为每分钟5毫升，通过连接到气管套管的注射泵通过气管。一旦 CFSE 溶液充满气管，停止泵。
10分钟后，使用注射泵注入10毫升PBS以除去残留的未掺入的CFSE试剂，以洗涤气管腔。洗涤后，通过连接到气管一端的鲁尔连接器将绿色晶状体的远端成像端插入气管。然后，轻轻地将绿色晶状体移入气管内，直到气管表面聚焦。
要在显微管理器软件中捕获明场图像，请通过笼状立方体用白光照亮气管腔。然后，单击“实时”图标以实时显示气管的管腔表面。使用“成像”设置和“曝光”选项卡将曝光时间更改为所需值。
要调整图像的对比度和亮度，请使用直方图和强度缩放窗口在交互式直方图显示的端点处移动黑白箭头。单击“停止实时”以激活“捕捉”图标，然后单击“捕捉”图标以冻结图像。接下来，使用“导出”和“图像作为置换选项卡”设置，以所需格式保存图像。
要在荧光模式下获取照片和视频，请通过笼状立方体用CFSE专用激光照亮气管腔，并通过来回移动成像探头实时获取图像。获得照片和视频后，轻轻地从气管中取出绿色晶状体。对于气管的去上皮化，通过气管套管滴入50微升新鲜制备的2%十二烷基硫酸钠，以在气管腔上产生洗涤剂溶液的薄膜。
滴注后，使用公头或母头鲁尔塞关闭生物反应器的管道连接，并将生物反应器转移到37摄氏度的培养箱中10分钟，以使SDS停留在气管内。重复滴注一次。第二次滴注后，通过注射泵以每分钟10毫升的流速用500微升PBS冲洗气管腔三次，以去除裂解的上皮和SDS。
然后，将生物反应器放在摇床上，以20赫兹的频率和0.3毫米的位移幅度进行机械振动，以物理方式促进SDS处理的上皮细胞从气管腔中分离。当气管被机械振动时，通过气管腔滴注500微升PBS两次，以除去残留的SDS和细胞碎片。去除上皮后，通过使用绿色晶状体成像装置测量CFSE的强度来评估上皮层的清除率。
制备去上皮化大鼠气管后，在37摄氏度的水浴中解冻冷冻的间充质干细胞或MSCs30秒。然后，用血细胞计数器计数细胞，然后制备浓度为每毫升6个细胞的5倍10倍的细胞溶液。然后，通过在室温下用两毫升100微摩尔CFSE溶液孵育细胞来荧光标记细胞。
15分钟后，用五毫升PBS冲洗细胞三次，然后将其重悬于新鲜的DMEM培养基中，最终浓度为每毫升10倍至7个细胞。如手稿所述，在制备胶原I水凝胶后，立即将细胞加入具有所需浓度的水凝胶溶液中。然后，将细胞和凝胶溶液与微量移液管混合，得到均匀的细胞 - 水凝胶混合物。
接下来，通过鲁尔连接器将生物反应器内气管的一端连接到可编程注射泵上，并将五毫升新鲜培养基以37摄氏度的速度输送到生物反应器室中，以覆盖气管的外表面。然后，将10微升的细胞 - 水凝胶混合物推注到生物反应器内的去上皮化气管中，以在气管腔上产生细胞水凝胶层。细胞注射后，将生物反应器置于37摄氏度和5%二氧化碳的无菌细胞培养箱中进行烧制30分钟以进行糖化，以进行糖化。
为了可视化植入细胞的分布，用70%异丙醇或乙醇对绿色晶状体进行灭菌，并将生物反应器放在成像台上，以获得明场和荧光模式下的照片和视频。细胞接种30分钟后，以每分钟一毫升的流速将一毫升培养基注入气管腔中。最后，在37摄氏度的培养箱中在生物反应器内培养细胞接种的气管，以达到所需的时间。
在细胞培养过程中，保持管腔内的培养基不变，而气管外的培养基通过单向流动连续灌注。在去上皮化气管的明场和荧光图像中，在CFSE标记之前没有观察到荧光信号。使用CFSE，在整个上皮细胞中观察到均匀的荧光信号。
去上皮化后，荧光强度显着降低，表明上皮消融。去上皮化气管的苏木精和曙红染色表明，从气管腔中去除假分层上皮，并在下层组织层中保存细胞和细胞外基质或ECM微结构。此外，五色和三色染色证实了气管组织结构和ECM成分（如胶原蛋白和蛋白聚糖）的维持。
上皮细胞和胶原I的免疫荧光显示上皮完全去除并保留上皮下组织内的胶原I。扫描电子显微照片显示，天然气管中充满了多毛细胞和高脚杯细胞。在去上皮化的气管中，基底膜暴露出来，如细胞外基质纤维的网状网络和上皮细胞的缺失所示。
去除上皮化气管的荧光图像，在接种PBS和胶原蛋白时，如下所示。与通过培养基接种的细胞相比，通过水凝胶递送的荧光标记细胞在管腔内保持更均匀的粘附。细胞活力研究表明，细胞递送程序对细胞活力没有影响，超过90%的细胞仍然存活。
在去上皮化过程中创建洗涤剂薄膜并使用水凝胶作为细胞的递送载体是该方案成功的重要步骤。我们的下一个研究目标是将实验室培养的气道原代或干细胞植入去上皮化的气道组织上，以研究是否可以制备功能性气道组织。
