通过在空气-液体界面中暴露培养的人类肺细胞，评估空气中颗粒的急性吸入毒性

利用这种体外暴露系统，通过暴露ALI的培养人类肺细胞，对有关急性肺细胞毒性的空气中颗粒进行筛选有助于减少动物实验。此暴露系统的主要优点是径向气溶胶分布概念，导致均匀分布和粒子在细胞上的位置。在播种细胞之前，在六井板的每个井中加入2.5毫升的回火生长介质。

将无细胞培养插入物小心地放在孔内，并将一毫升的生长培养介质添加到每个细胞培养物的插入中。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板30分钟。细胞试青化后，在装满10毫升同位素溶液的杯子中稀释100微升细胞培养悬浮液。

在不摇晃的情况下慢慢倾斜杯子。在细胞计数器上，根据 A549 细胞的细胞特定测量参数确定每毫升可行细胞的数量和细胞生存能力。回火后，吸气细胞培养中的培养物插入并播种一毫升的 A549 细胞，密度为每毫升细胞的三倍十至五细胞。

通过轻轻的摇动和孵育24小时分配细胞悬浮液。通过压机正面的时间控制设置压榨时间。打开压缩空气阀的压缩空气供应。

使用压机前侧的压力调节器，将压缩空气压力设置为大约两个柱。拉出抽屉，按下按下按钮，然后读取数字压力开关上的按压压力。在物质容器中填充少量测试物质。

将柱塞插入物质容器中，然后稍微来回转动，将粉末均匀地分配到容器中。将物质容器（带柱塞）放在抽屉中，然后按下按下按钮。打开抽屉并拆下柱塞。

关键步骤是压榨必须专门压缩到物质容器内的粉饼中的测试物质，以便实现稳定的颗粒暴露。从气溶胶导向模块中拆下进气适配器和冷凝水反射器。用插头关闭气溶胶引导模块中的三个气溶胶进气孔，并关闭带虚拟活门的采样模块中的介质供应连接。

将真空管与气溶胶导向模块的管接头连接。使用手轮关闭模块并测量流量控制器的值。关闭几分钟后，值将减至每分钟 5 毫升以下。

启动气溶胶发生器软件。如果物质刮刀不在最低位置，请按"定位模式"按钮。将物质容器与压榨的测试材料倒置在物质刮刀上。

确保物质容器的玻璃朝前。将锁定板放在物质容器上的插槽中，然后拧紧黑色螺钉。将"进给"和"旋转"的值更改为所需的设置。

使用向下箭头向下推滑，用物质容器，直到物质刮刀靠近压榨物质。通过轻点质量流量控制器打开气溶胶发生器的压缩空气供应，然后单击"开始"按钮启动气溶胶生成。将进给速率设置为每小时 15 到 20 毫米，以避免等待时间过长。

通过观察细尘云，从下面放置一个小手电筒，在 Elutriator 的玻璃管后面，控制正确的颗粒生成。使用预热曝光介质启动介质电源，并填充采样模块，直到模块打开时覆盖下管。将盲细胞培养物插入曝光模块，向下泵送曝光介质，直到下管被介质覆盖，刀片的下侧与介质接触。

启动气溶胶发生器，关闭暴露模块，然后将暴露模块连接到气溶胶发生器的暴露模块插座。交货时间后 30 分钟，用橡胶塞密封 Elutriator 的暴露模块插座，并拆下盲插拔。重新填充曝光介质，直到下管被介质覆盖。

在钳子的帮助下，从六个井板中去除细胞培养插入物。将生长介质小心地从细胞培养物中倒掉，通过推翻插入物并使用移液器吸气并丢弃残留液体。将刀片放在曝光和清洁空气模块的暴露室中。

关闭模块并启动暴露实验，将暴露模块连接到气溶胶发生器的暴露模块出口和清洁空气模块同时连接到载波气体供应。实验完成后，断开曝光和清洁空气模块并密封暴露模块出口。单击"停止"按钮停止压缩空气供应和气溶胶发生器。

打开暴露和清洁空气模块，并使用钳子将细胞培养物插入到准备好的孵化后六孔板。在37摄氏度和空气液体界面上孵育6个井板以及未暴露的细胞培养物，24小时，5%的二氧化碳。曝光后24小时，将细胞培养物插入新准备好的6个井板中。

向每个细胞培养插入中添加一毫升新鲜准备的 WST1 溶液。仔细摇动板，以便将溶液均匀地分布到细胞上。在37摄氏度和5%的二氧化碳下，用细胞培养物孵育6个井板，孵育一小时。

之后，将 100 微升的上经液从每个六个井板转移到 96 井板。使用微孔板读卡器，测量参考波长为 650 纳米的 450 纳米的吸光度。CULTEX RFS 是一种专门设计的模块化体外暴露系统，使细胞能够直接和均匀地暴露在空气液体界面的空气中颗粒中。

将细胞暴露在清洁空气中不会随着时间的推移降低细胞的生存能力。暴露系统已成功验证，并建立为被测试化合物急性吸入危害的预测模型。A549细胞暴露在无毒性、中等或强毒性的不同测试物质中。

请确保您严格保留孵化时间、颗粒生成前期和颗粒沉积时间等时间框架。这种暴露方法主要设计用于细胞的颗粒暴露，但可以通过调整气溶胶生成方法扩展到液体气溶胶和气体的暴露。这种筛选方法能够对体外急性吸入毒性的可吸入颗粒物进行定性评估，从而减少通常提供这种毒理学评估的动物试验。

不要忘记，处理有毒测试物质可能极其危险，在处理此类化合物时，应始终采取预防措施，如戴手套、戴口罩。