该协议适合研究利什马尼亚毒性，因为它提供了脊椎动物宿主的皮皮感染的系统视图。采用此协议的主要优点是，它允许研究人员同时评估宿主炎症反应和寄生虫复制。此方法可用于描述与毒性相关的多个靶点和治疗，从而给皮肤利什曼病控制带来新的见解。
它也可以适用于其他小鼠菌株和利什马尼亚物种，导致皮肤利什曼病。这种检测有一些关键步骤，例如要求训练有素的人员能够舒适地与小鼠合作，并具有进行亚植物注射的经验，以避免意外接触传染性物质。演示这个程序的将是里卡多·赞皮耶里博士，一个来自我实验室的技术员。
首先在25厘米方的细胞培养瓶中种植L.amazonensis，含有10毫升的亲中基，在25摄氏度下生长三天。孵育后，移液器五毫升对数生长期原型培养成一个新的烧瓶。在烧瓶中加入5毫升的阿玛中型，并在34摄氏度下孵育3至4天。
在一个新的烧瓶中，用新鲜的阿玛培养剂，以一比三的比例稀释培养文化。然后再孵育三到五天。将 PBS 中稀释的斧头协议悬浮液的等分转移到 Neubauer 腔室，并计算非旗杆寄生虫。
然后，根据所需的接种剂量和预期接种数量稀释PBS中的悬浮液。用准备好的寄生虫悬浮液用 27 量针加载结核素注射器。确保小鼠用脚趾捏液完全麻醉，并在左后脚垫的亚植物组织中接种50微升悬浮液。
记录病变的进度每周一次，通过使用卡钳测量受感染和非感染脚垫的厚度，并计算两个脚垫之间的厚度差异，以评估病变进展。每个病变在玻璃组织研磨管中加入一毫升的亲介质，并称重管。在脚垫上喷洒 70% 乙醇进行消毒，并切除动物的脚部，以提取受感染的脚垫。
确保剪刀和钳子在70%乙醇中浸泡，确保它们灭菌。将脚垫放在无菌的培养皿中，用钳子和手术刀解剖。收集所有的软组织并丢弃骨头。
将收集的组织转移到玻璃组织研磨管，然后再次称重管以确定病变重量。与研磨机一起使组织均质10次，使组织完全破坏，并允许混合物沉降。收集20微升的上一杯，并加载到96井板的第一列和第一车道，根据手稿指示准备。
重复此步骤，为接下来的三条车道，使每个动物具有四倍的结果。使用多通道移液器将每一井均质化 10 次，并在第一柱将稀释样品的 20 微升转移到第二柱。继续串行稀释，直到到达最后一列，并丢弃稀释样品的最后 20 微升。
用薄膜密封盘子，并在潮湿的室内在25摄氏度下孵育7天。孵育后，在倒置显微镜下分析板，确定每条巷道的最后一个含寄生虫的井。利什马尼亚原生动物寄生虫在无脊椎动物和脊椎动物宿主的生命周期中以两种发育形式存在：普罗巴斯特和海巴斯特。
斧头条件可以模拟体外不同的宿主环境，保持寄生虫的形态和生存能力。与海脊动物的斧头条件模仿脊椎动物宿主的酸性环境和温度升高。在这些条件下，普罗马斯蒂戈特人将区分为合作伙伴。
当转移到中性pH值并在25摄氏度下孵育时，斧头海巴动物会变回长廊。在受感染的小鼠脚垫上观察到野生型和利什马尼亚铁调节器1的毒性差异。LIR1调节利什马尼亚的细胞内铁含量，调节铁出口，防止其细胞内积累到有毒水平。
包括肿胀和病变进展差异的感染分析显示，LIR1对体内的L.amazonensis至关重要。寄生虫负荷通过从受感染的病变进行限制稀释测定来确定。LIR1敲除感染小鼠的病变比野生型利什曼感染小鼠少10至6倍，表明LIR1的缺失可防止细胞内复制的亚巴斯特。
执行此过程时，要记住的最重要的事情之一是使用体外传播不到十次的利什马尼亚培养物，以避免寄生虫毒性的丧失。除了这个程序，你可以使用体外感染分析。然而，这是一个有限的方法，因为它不提供宿主-寄生虫相互作用的系统生理概述。
这种体内方法是评估皮肤利什曼病的全身反应的最佳方法，例如量化恢复宿主组织中血清生物标志物，以进行进一步的免疫学研究。
