このプロトコルは、皮状感染症に脊椎動物宿主の全身的な見解を提供するので、リーシュマニア病原性を研究するのに適している。このプロトコルを採用する主な利点は、研究者が同時に宿主の炎症反応と寄生虫複製を評価することができるということです。この方法は、毒性に関連するいくつかの標的および治療を特徴付けるために使用することができ、それは皮リーシュマニア症の制御に新しい洞察をもたらす可能性がある。
また、他のマウス株や皮リーシュマニア症を引き起こすリーシュマニア種にも適用できます。このアッセイには、マウスの作業に慣れ、感染性物質への偶発的な暴露を避けるために板下注射を行った経験がある訓練を受けた人員を必要とするなど、いくつかの重要なステップがあります。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるリカルド・ザンピエリ博士です。
25センチメートル平方細胞培養フラスコでL.アマゾネンシスのプロマスティゴトを成長させることから始め、10ミリリットルのプロミディアムを含み、摂氏25度で3日間栽培します。インキュベーション後、ピペット5ミリリットルの対数成長相プロマスティゴテ培養を新しいフラスコに培養する。フラスコにアマ培地を5ミリリットル加え、3~4日間摂氏34度でインキュベートします。
新しいフラスコに新鮮なアマ培地で1〜3の比率で希釈することによって培養を分割します。その後、さらに3〜5日間インキュベートします。PBSで希釈したアキセン酸アマスチゴス懸濁液のアリコートをノイバウアーチャンバーに移し、非フラグを立て寄生虫を数える。
次いで、所望の接種量および意図される接種数に応じてPBS中の懸濁液を希釈する。準備された寄生虫の懸濁液と27ゲージ針で結核注射器をロードします。マウスがつま先ピンチで完全に麻酔され、サスペンションの50マイクロリットルを左後ろ足パッドの板前組織に接種することを確認します。
週に1回の病変の進行を記録し、キャリパーを用いて感染したフットパッドと非感染フットパッドの厚さを測定し、2つのフットパッド間の厚さの差を計算して病変進行を評価する。1回の病変にガラス組織グラインダーチューブにプロミドを1ミリリットル加え、チューブの重量を量る。感染したフットパッドを抽出するために、フットパッドに70%エタノールをスプレーし、そのかかとで動物の足を切除します。
はさみと鉗子を70%エタノールに浸して、殺菌することを確認して下さいます。無菌ペトリ皿にフットパッドを置き、鉗子とメスでそれを解剖します。すべての軟部組織を収集し、骨を捨てます。
採取した組織をガラス組織グラインダーチューブに移し、チューブを再び秤量して病変重量を決定します。完全な組織破壊のためにグラインダーで組織を10回均質化し、混合物を解決させます。上清の20マイクロリットルを収集し、原稿の指示に従って調製された96ウェルプレートの第1列および第1レーンにロードする。
次の 3 つのレーンでこの手順を繰り返して、各動物の結果を 4 倍にします。マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルを10回均質化し、希釈したサンプルの20マイクロリットルを第1カラムから第2列に移す。最後のカラムに到達するまでシリアル希釈を続け、希釈したサンプルの最後の20マイクロリットルを捨てます。
プレートをフィルムで密封し、湿気の多いチャンバーで7日間摂氏25度でインキュベートします。インキュベーション後、反転顕微鏡でプレートを分析し、各レーンの最後の寄生虫含有ウェルを決定します。リーシュマニア原虫寄生虫は、無脊椎動物および脊椎動物の宿主におけるライフサイクル中の2つの発達形態に存在する:プロマスチゴテおよびアマスチゴテ。
無菌状態は、異なる宿主環境をインビトロでシミュレートし、寄生虫の形態と生存率を維持することができる。アマスチゴの無分離条件は、脊椎動物の宿主の酸性環境および温度上昇を模倣する。プロマスティゴトは、これらの条件下でアマスティゴトに分化します。
中性pHに移し、摂氏25度でインキュベートすると、無化症性のアマスチゴはプロマスティゴテに戻る。野生型とリーシュマニア鉄レギュレータ1ノックアウト株の病原性差は、感染したマウスのフットパッドで観察された。LIR1はリーシュマニアの細胞内鉄レベルを調節し、鉄の輸出を媒介し、細胞内蓄積を有毒レベルに予防します。
腫脹および病変進行の違いを含む感染アッセイは、LIR1が生体内のL.アマゾネンシスに不可欠であることを明らかにした。寄生虫負荷は、感染病変からの限定希釈アッセイを行うことにより決定した。LIR1ノックアウト感染マウスの病変は、野生型リーシュマニア感染マウスの寄生虫よりも10〜6倍少ない寄生虫を含み、LIR1の不在がアマスチゴトの細胞内複製を妨すことを明らかにした。
この手順を実行するときに覚えておくべき最も重要なことの1つは、寄生虫毒性の喪失を避けるために10回未満の体液で継代されたリーシュマニア文化を使用することです。この手順に加えて、インビトロ感染アッセイを使用することができます。しかし、これは限られた方法であり、宿主寄生虫相互作用の全身的な生理学的概観を提供しないためである。
このin vivo法は、さらなる免疫学的研究のために回収された宿主組織における血清バイオマーカーの定量化など、皮リーシュマニア症に対する全身応答を評価するための最良のアプローチである。
