פרוטוקול זה מתאים לחקר ארסיות לישמניה, משום שהוא מספק תצוגה מערכתית של מארח החולייתנים לזיהום עורי. היתרון העיקרי של אימוץ פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר לחוקרים להעריך את התגובה הדלקתית המארחת ואת שכפול הטפיל בו זמנית. שיטה זו יכולה לשמש לאפיון מספר מטרות וטיפולים הקשורים ארסיות, אשר יכול להביא תובנות חדשות לתוך בקרת לישמניאזיס עורית.
זה יכול להיות מיושם גם על זני עכברים אחרים מיני לישמניה הגורמים לישמניאזיס עורית. בדיקה זו כוללת כמה צעדים קריטיים, כגון דרישת כוח אדם מיומן שנוח להם לעבוד עם עכברים ויש להם ניסיון בביצוע זריקות תת-כוכביות כדי למנוע חשיפה מקרית לחומר זיהומי. הדגמת ההליך תהיה ד"ר ריקרדו זמפיירי, טכנאי מהמעבדה שלי.
התחל על ידי גידול L.amazonensis promastigotes בבקבוק תרבות תאים בריבוע 25 ס"מ, המכיל 10 מיליליטר של פרו בינוני, במשך שלושה ימים ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, פיפטה חמישה מיליליטר של תרבות פרומסטיגוט צמיחה לוגריתמית לתוך בקבוקון חדש. מוסיפים חמישה מיליליטר של אמא-מדיום לבקבוק, ומדירים אותו ב-34 מעלות צלזיוס במשך שלושה עד ארבעה ימים.
לפצל את התרבות על ידי דילול אותו ביחס של אחד עד שלושה עם אמא בינוני טרי בבקבוקון חדש. ואז לה הדגירה אותו לעוד שלושה עד חמישה ימים. העבר aliquot של ההשעיה amastigotes גרזן מדולל PBS לתא Neubauer ולספור את הטפילים ללא דגל.
לאחר מכן, לדלל את ההשעיה PBS על פי המינון הרצוי inoculum ואת מספר אינוקולומים המיועדים. לטעון מזרק tuberculin עם מחט מד 27 עם ההשעיה טפיל מוכן. ודא כי העכבר הוא הרדמה מלאה עם קמצוץ בוהן לחסן 50 microliters של ההשעיה לתוך רקמת תת כוכבית על הרגל האחורית השמאלית.
רשום את התקדמות הנגע פעם בשבוע, על ידי מדידת עובי של משטחי הרגליים הנגועים והבלתי נגועים באמצעות caliper, ולחשב את ההבדל בעובי בין שני footpads כדי להעריך את התקדמות הנגע. מוסיפים מיליליטר אחד של פרו-מדיום בצינור מטחנת רקמת זכוכית לכל נגע ומשקללים את הצינור. ריסוס 70% אתנול על כף הרגל לחיטוי ובלה את רגל החיה על העקב שלה כדי לחלץ את כף הרגל הנגועה.
ודא כי המספריים והמדפים מעוכלים על ידי שמירה עליהם ספוגים 70% אתנול. מניחים את משטח הרגליים בצלחת פטרי סטרילית ומ לנתח אותו עם מטלאים ואזמל. לאסוף את כל הרקמה הרכה ולהשליך את העצמות.
מעבירים את הרקמות שנאספו לצינור מטחנת רקמת הזכוכית ומשקללים את הצינור שוב כדי לקבוע את משקל הנגר. הומוגניזציה של הרקמה 10 פעמים עם המטחנה לשיבוש רקמות מלא, ולאפשר את התערובת להתיישב. לאסוף 20 microliters של supernatant טען אותו בעמודה הראשונה ואת הנתיב הראשון של צלחת 96 באר, מוכן על פי הוראות כתב היד.
חזור על שלב זה כדי ששלושת הנתיבים הבאים יהיו בעלי תוצאות מרובעות עבור כל חיה. הומוגניזציה של כל באר 10 פעמים באמצעות פיפטה רב-ערוצית, והעברת 20 מיקרוליטרים של המדגם המדולל מהעמודה הראשונה לעמודה השנייה. המשך בדילול הסידורי עד להגעה לעמודה האחרונה ומחק את 20 המיקרוליטרים הסופיים של המדגם המדולל.
לאטום את הצלחת עם הסרט, ודגירה אותו ב 25 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים בתא לח. לאחר הדגירה, לנתח את הצלחת תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לקבוע את הטפיל האחרון המכיל היטב עבור כל נתיב. טפילי ליישמניה פרוטוזואן קיימים בשתי צורות התפתחותיות במהלך מחזור חייהם במארחים חסרי חוליות ובעלי חוליות: פרומסטיגוטים וצברים.
תנאים ציריים יכולים לדמות סביבות מארח שונות במבחנה, תוך שמירה על מורפולוגיה טפיל וכדאיות. תנאים ציריים עבור amastigotes לחקות את הסביבה החומצית ואת הטמפרטורה המוגברת של המארחים בעלי החוליות. פרומסטיגוטים יתבדלו לתוך מצבות בתנאים אלה.
כאשר מועברים pH ניטרלי דגירה ב 25 מעלות צלזיוס, amastigotes גרזן להפוך בחזרה promastigotes. ההבדל ארסיות של סוג פראי וישמניה איירון הרגולטור 1 זני נוקאאוט נצפתה על משטחי עכבר נגועים. LIR1 מווסת את רמות הברזל תאיים בלישמניה, מתווך ייצוא ברזל ומניעת הצטברות תאית שלה לרמות רעילות.
מקדם הזיהום הכולל את ההבדל בהתקדמות הנפיחות והנגע גילה כי LIR1 חיוני עבור L.amazonensis ב vivo ארסיות. עומס הטפיל נקבע על ידי ביצוע בדיקות דילול מגבילות מהנגעים הנגועים. הנגעים של עכברים נגועים נוקאאוט LIR1 מכילים 10 עד 6 טפילים פחות מאשר אלה של עכברים נגועים Leishmania סוג הבר, מגלה כי היעדר LIR1 מונע שכפול תאי של המחסות.
אחד הדברים החשובים ביותר שיש לזכור בעת ביצוע הליך זה הוא להשתמש בתרבויות לישמניה שהיו קטעו במבחנה פחות מעשר פעמים, כדי למנוע אובדן של ארסיות טפיל. בנוסף להליך זה, אתה יכול להשתמש במבחנה מוצגים זיהום. עם זאת, זוהי שיטה מוגבלת, כי זה לא מספק סקירה פיזיולוגית מערכתית של אינטראקציה המארח-טפיל.
שיטת in vivo זו היא הגישה הטובה ביותר להערכת תגובות מערכתיות עבור לישמניאזיס עורית, כגון כימות סמנים ביולוגיים בסרום ברקמות מארחות משוחזרות למחקרים אימונולוגיים נוספים.
