Этот протокол подходит для изучения вирулентности Лейшмании, так как обеспечивает системное представление о позвоночном хозяине к кижной инфекции. Основным преимуществом принятия этого протокола является то, что он позволяет исследователям оценить воспалительной реакции хозяина и репликации паразитов одновременно. Этот метод может быть использован для характеристики нескольких целей и методов лечения, связанных с вирулентностью, которые могли бы принести новые идеи в кокенозный контроль лейшманиоза.
Он также может быть применен к другим штаммам мышей и лейшмании видов, которые вызывают кокеноз лейшманиоз. Этот анализ имеет некоторые важные шаги, такие как требование квалифицированного персонала, которые комфортно работать с мышами и имеют опыт в выполнении субплантарных инъекций, чтобы избежать случайного воздействия инфекционного материала. Демонстрацией процедуры будет доктор Рикардо Зампьери, техник из моей лаборатории.
Начните с выращивания L.amazonensis promastigotes в 25-сантиметровой квадратной клеточной культуре колбы, содержащей 10 миллилитров про-среды, в течение трех дней при 25 градусах по Цельсию. После инкубации пипетка пять миллилитров логаритмической фазы роста промастигот культуры в новую колбу. Добавьте пять миллилитров ама-среды в колбу и инкубировать при 34 градусах по Цельсию в течение трех-четырех дней.
Разделите культуру, разбавляя ее в соотношении один к трем со свежей ама-средой в новой колбе. Затем инкубировать его еще три-пять дней. Перенесите алицит подвески топорных амистиготов, разбавленных в PBS, в камеру Нойбауэра и подсчитайте паразитов, не являющееся флагманами.
Затем разбавьте суспензию в PBS в соответствии с желаемой дозой инокулума и количеством инокульмов, предназначенных. Загрузите туберкулин шприц с 27 калибровочных игл с подготовленной подвеской паразита. Убедитесь, что мышь полностью анестезируется с щепоткой ног и привить 50 микролитров подвески в субплантарной ткани на левой задней ноге.
Запись прогрессирования поражения один раз в неделю, путем измерения толщины инфицированных и неинфицированных подножки с помощью калипера, и рассчитать разницу в толщине между двумя footpads для оценки прогрессирования поражения. Добавить один миллилитр про-средних в стеклянной ткани шлифовальной трубки на поражение и взвесить трубку. Спрей 70% этанола на подножку для дезинфекции и акциз ноги животного на пятку, чтобы извлечь инфицированные подножки.
Убедитесь, что ножницы и типсы стерилизованы, сохраняя их пропитанной 70% этанола. Поместите подножье в стерильную чашку Петри и рассекаете ее типсами и скальпелем. Соберите все мягкие ткани и отбросьте кости.
Перенесите собранные ткани в стеклянную трубку шлифовальной машины и взвесите трубку снова, чтобы определить вес поражения. Гомогенизировать ткани 10 раз с мясорубки для полного разрушения тканей, и позволить смеси урегулирования. Соберите 20 микролитров супернатанта и загрузите его в первую колонну и первую полосу 96-й плиты, подготовленной в соответствии с рукописными указаниями.
Повторите этот шаг для следующих трех полос, чтобы иметь четырехкратные результаты для каждого животного. Гомогенизировать каждую колодец 10 раз с помощью многоканальной пипетки и перенести 20 микролитров разбавленного образца из первой во вторую колонну. Продолжайте серийное разбавление до тех пор, пока не будет достигнута последняя колонка, и отбросьте последние 20 микролитров разбавленного образца.
Печать пластины с пленкой, и инкубировать его при 25 градусов по Цельсию в течение семи дней во влажной камере. После инкубации проанализируйте пластину под перевернутым микроскопом, чтобы определить последний паразитсодержащих хорошо для каждой полосы. Простейшие паразиты Лейшмании существуют в двух формах развития в течение их жизненного цикла у беспозвоночных и позвоночных хозяев: промастиготов и амастиготов.
Axenic условия могут имитировать различные среды хозяина в пробирке, поддержание морфологии паразита и жизнеспособности. Топорные условия для амастиготов имитируют кислую среду и повышенную температуру позвоночных хозяев. Promastigotes будет дифференцироваться в амастиготы в этих условиях.
При переводе в нейтральный рН и инкубации при 25 градусах по Цельсию топорные амистиготы превращаются обратно в промастиготы. Вирулентность разница дикого типа и Лейшмания железа Регулятор 1 нокаут штаммов наблюдалось на инфицированных мышей подножки. LIR1 регулирует внутриклеточный уровень железа в Лейшмании, о посредничестве экспорта железа и предотвращении его внутриклеточного накопления до токсичных уровней.
Инфекция анализ, который включает в себя разницу в отек и прогрессирование поражения показали, что LIR1 имеет важное значение для L.amazonensis in vivo вирулентности. Паразитная нагрузка была определена путем выполнения ограничивающих анализ разбавления от инфицированных поражений. Поражения LIR1 нокаут инфицированных мышей содержат от 10 до шести раз меньше паразитов, чем у диких типа Leishmania инфицированных мышей, показывая, что отсутствие LIR1 предотвращает внутриклеточную репликацию аматтиготов.
Одна из самых важных вещей, чтобы помнить, когда вы выполняете эту процедуру заключается в использовании лейшмании культур, которые были проходные в пробирке менее десяти раз, чтобы избежать потери паразита вирулентности. В дополнение к этой процедуре, вы можете использовать в пробирке инфекции анализы. Однако, это ограниченный метод, потому что он не обеспечивает системный физиологический обзор взаимодействия хозяина-паразита.
Этот метод in vivo является наилучшим подходом для оценки системных реакций на кокеноз лейшманиоз, таких как количественная оценка биомаркеров сыворотки в восстановленных тканях хозяина для дальнейших иммунологических исследований.
