Bu protokol Leishmania virülansını incelemek için uygundur, çünkü kutanöz enfeksiyona omurgalı konak sistemik bir görünüm sağlar. Bu protokolü benimseyen en büyük avantajı, araştırmacıların konak inflamatuar yanıtı ve parazit replikasyonlarını aynı anda değerlendirmelerine olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, kutanöz leishmaniasis kontrolüne yeni anlayışlar getirebilecek virülans ile ilgili çeşitli hedeflerin ve tedavilerin karakterize edilmesinde kullanılabilir.
Ayrıca kutanöz leishmaniasis neden diğer fare suşları ve Leishmania türlerine uygulanabilir. Bu teşp, farelerle rahat çalışan ve bulaşıcı materyale kazara maruz kalmamak için subplantar enjeksiyonları gerçekleştirme deneyimine sahip eğitimli personel gerektiren bazı kritik adımlar vardır. Prosedürü gösteren Dr.Ricardo Zampieri, laboratuvarımdan bir teknisyen.
25 santimetre kare hücre kültürü şişesinde L.amazonensis promastigotes büyüterek başlayın, pro-orta 10 mililitre içeren, 25 santigrat derece üç gün boyunca. Kuluçkadan sonra, pipet logaritmik büyüme fazı promastigot e-kültür yeni bir şişe içine beş mililitre. Şişeye beş mililitre ama-orta ekleyin ve 34 santigrat derecede 3-4 gün kuluçkaya yatırın.
Yeni bir şişede taze ama-orta ile 1-3 oranında seyrelterek kültür bölün. Sonra 3-5 gün daha kuluçkaya yatırın. PBS'de seyreltilmiş axenic amastigotes süspansiyonunun bir aliquot'unun Neubauer odasına aktarılması ve kamçısız parazitleri sayması.
Daha sonra, istenilen inokül dozu ve amaçlanan inoculumsayısına göre PBS süspansiyon seyreltmek. Hazırlanan parazit süspansiyonu ile 27 gauge iğne ile bir tüberkülin şırınga yükleyin. Farenin bir ayak tutamı ile tamamen anestezi altında olduğundan emin olun ve süspansiyonun 50 mikrolitresini sol arka ayak alt takim inkistarına aşılayın.
Bir kaliper kullanarak enfekte ve enfekte olmayan ayak altlıklarının kalınlığını ölçerek haftada bir lezyonun ilerlemesini kaydedin ve lezyon progresyonunu değerlendirmek için iki ayak takımı arasındaki kalınlık farkını hesaplayın. Lezyon başına bir cam doku öğütücü tüp pro-orta bir mililitre ekleyin ve tüp tartMak. Dezenfeksiyon için ayak altına %70 etanol püskürtün ve enfekte footpad'i çıkarmak için hayvanın ayağını topuklarından çıkar.
Makas ve forceps% 70 etanol içinde ıslatılmış tutarak sterilize olduğundan emin olun. Bir steril Petri kabına footpad yerleştirin ve forceps ve neşter ile incelemek. Tüm yumuşak doku toplamak ve kemikleri atın.
Toplanan dokuları cam doku öğütücü tüpüne aktarın ve lezyon ağırlığını belirlemek için tüpü tekrar tarttırın. Tam doku bozulması için öğütücü ile doku homojenize ve yerleşmek için karışımı sağlar. Supernatant 20 mikrolitre toplamak ve el yazması yönergelerine göre hazırlanan 96 kuyu plaka, ilk sütun ve ilk şeritte yükleyin.
Her hayvan için dört katına sonuçlar elde etmek için sonraki üç şerit için bu adımı tekrarlayın. Çok kanallı pipet kullanarak her kuyuyu 10 kez homojenize edin ve seyreltilmiş numunenin 20 mikrolitresini birinci sütundan ikinci sütuna aktarın. Son sütuna ulaşılına kadar seri seyreltme devam edin ve seyreltilmiş numunenin son 20 mikrolitresini atın.
Plakayı filmle kapatın ve nemli bir odada yedi gün boyunca 25 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, her şerit için son parazit içeren kuyuyu belirlemek için ters bir mikroskop altında plakayı analiz edin. Leishmania protozoan parazitler omurgasız ve omurgalı konaklarında yaşam döngüleri boyunca iki gelişimsel formda bulunurlar: promastigotes ve amastigotes.
Axenic koşullar parazit morfolojisi ve canlılık koruyarak, in vitro farklı konak ortamları simüle edebilirsiniz. Amastigotlar için axenic koşulları asidik ortamı ve omurgalı konaklarının artan sıcaklığını taklit eder. Promastigotes bu koşullar altında amastigotes farklılaşır.
Nötr pH'a aktarıldığında ve 25 santigrat derecede kuluçkaya yattığında, baltalı amastigotes promastigotes'e dönüşür. Yabani tip ve Leishmania Demir Regülatörü 1 nakavt suşlarının virülans farkı enfekte fare ayak altlıklarında gözlendi. LIR1, Leishmania'daki hücre içi demir seviyelerini düzenler, demir ihracatına aracılık eder ve hücre içi birikimini toksik seviyelere kadar önler.
Şişlik ve lezyon ilerlemesi ndeki farkı içeren enfeksiyon analizi, LIR1'in l.amazonensis in vivo virülans için gerekli olduğunu ortaya koymuştur. Parazit yükü enfekte lezyonlardan sınırlı seyreltme tetkikleri ile belirlendi. LIR1 nakavt enfekte farelerin lezyonları vahşi tip Leishmania enfekte farelerdaha altı kat daha az parazit içeren, LIR1 yokluğu amastigotes hücre içi çoğalmasını önler ortaya koymaktadır.
Bu işlemi yaparken hatırlanması gereken en önemli şeylerden biri parazit virülans kaybını önlemek için on kereden az in vitro geçit edildi Leishmania kültürleri kullanmaktır. Bu prosedüre ek olarak, in vitro enfeksiyon tahlilleri kullanabilirsiniz. Ancak, bu sınırlı bir yöntemdir, çünkü konak-parazit etkileşiminin sistemik fizyolojik genel görünümünü sağlamaz.
Bu in vivo yöntemi, daha ileri immünolojik çalışmalar için kurtarılan konak dokularda serum biyobelirteçlerinin ölçülmesi gibi kutanöz leishmaniasis için sistemik yanıtları değerlendirmek için en iyi yaklaşımdır.
