Este protocolo é adequado para estudar a virulência de Leishmania, pois fornece uma visão sistêmica do hospedeiro vertebrado para a infecção cutânea. A principal vantagem de adotar esse protocolo é que ele permite que os pesquisadores avaliem a resposta inflamatória hospedeira e a replicação de parasitas simultaneamente. Este método pode ser usado para caracterizar vários alvos e tratamentos relacionados à virulência, o que poderia trazer novos insights sobre o controle da leishmaniose cutânea.
Também pode ser aplicado a outras cepas de camundongos e espécies de Leishmania que causam leishmaniose cutânea. Este ensaio tem algumas etapas críticas, como exigir pessoal treinado que se sinta confortável trabalhando com camundongos e tenha experiência na realização de injeções subplantar para evitar exposição acidental a material infeccioso. Demonstrando o procedimento estará o Dr. Ricardo Zampieri, técnico do meu laboratório.
Comece cultivando promastigotes de L.amazonensis em um frasco de cultura celular quadrada de 25 centímetros, contendo 10 mililitros de pró-médio, por três dias a 25 graus Celsius. Após a incubação, pipetas cinco mililitros de cultura de promastigote fase de crescimento logarítmico em um novo frasco. Adicione cinco mililitros de ama-médio ao frasco, e incuba-o a 34 graus Celsius por três a quatro dias.
Divida a cultura diluindo-a em uma proporção de um a três com ama-médio fresco em um novo frasco. Em seguida, incuba-lo por mais três a cinco dias. Transfira uma alíquota da suspensão de amastigotes axenic diluída em PBS para uma câmara de Neubauer e conte os parasitas não sinalizados.
Em seguida, diluir a suspensão em PBS de acordo com a dose inóculo desejada e o número de inóculos pretendidos. Carregue uma seringa tuberculina com uma agulha calibre 27 com a suspensão do parasita preparada. Certifique-se de que o mouse está totalmente anestesiado com uma pitada do dedo do pé e inocula 50 microliters da suspensão no tecido subplantar no fundo traseiro esquerdo.
Regissão da lesão uma vez por semana, medindo a espessura dos footpads infectados e não infectados usando uma pinça, e calcule a diferença de espessura entre os dois footpads para avaliar a progressão da lesão. Adicione um mililitro de pró-médio em um tubo de moedor de tecido de vidro por lesão e pese o tubo. Pulverizar 70% de etanol no footpad para desinfecção e extirver o pé do animal em seu calcanhar para extrair o footpad infectado.
Certifique-se de que a tesoura e fórceps sejam esterilizados mantendo-os encharcados em 70% de etanol. Coloque o bloco de pés em uma placa de Petri estéril e disseque-o com os fórceps e bisturi. Recolhe todo o tecido mole e descarta os ossos.
Transfira os tecidos coletados para o tubo moedor de tecido de vidro e pese novamente o tubo para determinar o peso da lesão. Homogeneize o tecido 10 vezes com o moedor para interrupção completa do tecido, e permita que a mistura se aposente. Colete 20 microlitadores do supernascer e carregue-o na primeira coluna e primeira faixa da placa do poço 96, preparada de acordo com as instruções do manuscrito.
Repita esta etapa para que as próximas três pistas tenham resultados quadruplicas para cada animal. Homogeneize cada poço 10 vezes usando uma pipeta multicanal, e transfira 20 microliters da amostra diluída da primeira para a segunda coluna. Continue a diluição seriada até que a última coluna seja atingida, e descarte os 20 microlitadores finais da amostra diluída.
Sele a placa com filme, e incuba-a a 25 graus Celsius por sete dias em uma câmara úmida. Após a incubação, analise a placa sob um microscópio invertido para determinar o último poço contendo parasitas para cada pista. Parasitas protozoários leishmania existem em duas formas de desenvolvimento durante seu ciclo de vida em hospedeiros invertebrados e vertebrados:promastigotes e amastigotes.
As condições axenicas podem simular diferentes ambientes hospedeiros in vitro, mantendo a morfologia e viabilidade do parasita. Condições axenicas para amastigotes imitam o ambiente ácido e aumento da temperatura dos hospedeiros vertebrados. Promastigotes se diferenciarão em amastigotes nessas condições.
Quando transferidos para pH neutro e incubados a 25 graus Celsius, amastigotes axenic transformam-se de volta em promastigotes. A diferença de virulência do tipo selvagem e as cepas de nocaute do Regulador de Ferro Leishmania 1 foram observadas em footpads de rato infectados. O LIR1 regula os níveis intracelulares de ferro na Leishmania, mediando a exportação de ferro e impedindo seu acúmulo intracelular a níveis tóxicos.
O ensaio de infecção que inclui a diferença no inchaço e na progressão da lesão revelou que o LIR1 é essencial para l.amazonensis in vivo virulence. A carga do parasita foi determinada pela realização de um ensaio de diluição limitante das lesões infectadas. As lesões dos camundongos infectados pelo nocaute LIR1 contêm de 10 a seis parasitas a menos do que os camundongos infectados por Leishmania, revelando que a ausência de LIR1 impede a replicação intracelular dos amastigotes.
Uma das coisas mais importantes a se lembrar quando você está realizando este procedimento é usar culturas leishmania que foram passagem in vitro menos de dez vezes para evitar a perda de virulência de parasitas. Além deste procedimento, você pode usar ensaios de infecção in vitro. No entanto, este é um método limitado, pois não fornece uma visão geral fisiológica sistêmica da interação hospedeiro-parasita.
Este método in vivo é a melhor abordagem para avaliar respostas sistêmicas para leishmaniose cutânea, como quantificar biomarcadores de soro em tecidos hospedeiros recuperados para estudos imunológicos posteriores.
