我们的培养系统捕获肺鳞状细胞癌细胞的表型可塑性，以响应肿瘤-频闪相互作用，以及这些相互作用在肺鳞状细胞癌进展期间如何调节肿瘤形态。我们系统的主要优点是能够在三维环境中对肺鳞状细胞生物学进行建模，同时保持恶性细胞的可塑性。这种3D共培养提供了一个独特的系统来研究肿瘤-频闪细胞的相互作用，并可以适应监测肺鳞状细胞和癌症相关成纤维细胞对药物治疗的反应。
首先，在四摄氏度的冰箱中解冻地下室膜基瓶过夜。在零下 20 摄氏度的温度下冷却两毫升塑料移液器和提示。第二天，在37摄氏度的水浴中加热用于分离TUM622细胞、HEPES缓冲液、三辛/EDTA和三辛中和缓冲液的试剂。
将解冻的地下室膜基质从冰箱中取出，将小瓶放在冰上。冷却放置在冰上的金属平台冷却器上的组织培养板。将离心管放在冰上金属冷却架上。
根据要准备的每个井中的井数和细胞浓度计算所需的细胞量。将 TUM622 电池悬浮液转移到冷却的离心管中，在 4 摄氏度的悬挂式铲斗离心机中以 300 倍 g 的速率旋转，5 分钟。将吸气移液器连接到未过滤的尖端上，小心吸升，将介质的约 200 微升留在管子中。
轻轻敲击管的一侧以分离和分离颗粒，然后将其返回到冷却架。使用两毫升预冷移液器，通过上下移液几次，轻轻地将基质混合在冰上。以均匀和中等速度移液，以便在此过程中不会将气泡引入矩阵中。
将1.1毫升的基质转移到每个离心管中。使用预冷尖端，移液器矩阵在每个管上下约10次，使一个均匀的细胞悬浮。将 310 微升的电池基质悬浮液转移到预冷 24 井板的每个井中。
将移液器以 90 度角放置到板表面，并将悬架添加到井的中心。悬架扩散并覆盖整个井。为了便于下游免疫荧光分析，将60微升细胞基质悬浮液转移到双井腔滑轨的井中心。
这允许矩阵形成一个圆顶样的结构，体积要小得多。将板和腔室滑回组织培养箱并孵育30分钟，使基质凝固。之后，在光学显微镜下检查板和滑动，以确保单个细胞均匀地分布在矩阵中。
将一毫升预热 3D 培养物将完整的培养介质添加到板的每个井中，将 1.5 毫升的 3D 培养物添加到腔室幻灯片的每个井中，然后将它们返回到培养箱中。如前所述，制备 TUM622 和 CAF 的细胞悬浮液后，通过将 10 微升细胞悬浮液与 10 微升的 trypan 蓝色混合来计算 CAF 细胞密度。在血细胞计上的两个腔室中加入10微升混合物，以计算和计算细胞密度。
要将TUM622细胞和CAF共同嵌入地下室膜基质中，首先根据细胞密度信息计算用于电镀的所需细胞数量。CAF 以 TUM622 细胞的 2：1 比率播种。将计算的TUM622和CAF电池悬浮液的体积转移到同一个离心管中。
向下旋转并吸气所有介质。将混合物重新放入地下膜基质和板310微升的混合物中，放入24孔板的每个孔中。对于免疫荧光，将 60 微升 TUM622 和 CAF 混合物转移到室滑梯上，如前所述。
要将 TUM622 与基底膜矩阵中的叠加 CAF 进行共培养，请先设置如前所述的 TUM622 单培养，将 CAF 悬浮液数的两倍转移到离心管中，并在室温下以 300 次 g 旋转，5 分钟。吸增生并重新在培养基中重新暂停 CAF，将培养基中重新暂停的 CAF 细胞数的两倍转移到包含嵌入的 TUM622 细胞的每个孔中。2D 培养中的典型 TUM622 细胞用大核四舍五入，而 CAF 则是扁平和拉长的。
在3D培养中播种，单个TUM622细胞在嵌入时能够形成具有类似形态的器官。在第五天至第七天之间，流明在类似青霉的结构中变得明显，此后仍然空心。每种青霉素，由围绕空心流明的单层细胞组成，表现出与体内肺上皮相似的适当的基础极性。
这些类似钙质的结构是超塑性，并持续生长，直到24天前，细胞外基质完全解体。在 TUM622-CAF 共培养中，无论是叠加还是共嵌入，CAF 的存在极大地增强了形成的球体的数量和大小。有趣的是，当TUM622阿奇尼接近CAF时，他们诱导acini变得侵入性，并迁移到CAF，形成泪滴样结构。
为了确保类似辛纳的结构的强健形成，在细胞嵌入的整个过程中，保持基底膜基质的液体形式至关重要。TUM622有机物可用于各种下游分析，包括但不限于免疫荧光、免疫组织化学、流细胞学、RNA和蛋白质提取，还可以进行药物筛选。利用该系统作为平台，可以研究肿瘤细胞内在以及肿瘤微环境细胞外在变化如何影响肿瘤上皮结构及癌形成。
