这些模型可以实施,以评估伤口愈合反应的各个方面,包括细胞和细胞因子动力学和伤口闭合。PVA 海绵模型允许恢复数百万个伤口白细胞进行表型和功能分析,而尾皮肤切除模型允许缓慢愈合的伤口的轻松可视化。PVA 海绵和切除尾伤模型可与合并疾病(如糖尿病或肺炎)结合使用,以了解其对伤口愈合的影响。
与梅雷迪斯·克莱恩一起演示这些程序的将是比尔·亨利,一个来自我实验室的研究助理。在开始实验之前,用剪刀将PVA海绵切成八分之八到四毫米的碎片。在洗脱PBS中的海绵片中再加水10分钟,然后对PBS中的海绵进行消毒。
当海绵冷却后,将浸入PBS中的海绵储存在摄氏四度。在手术当天,将每个实验动物的六块海绵放入无菌层流罩中的无菌培养皿中,并确认在麻醉的8至12周大、雄性C57-Black/6小鼠中对头趾捏的缺乏反应。有一个助理使用剪子去除头发沿多苏姆和无菌纱布应用波维酮碘溶液剃光区域两次,然后一个单一的70%乙醇应用。
然后,助手应将鼠标转移到放置在加热垫上的无菌手术窗帘上。戴上无菌手套,用钳子将背皮从底层组织中拉离,并使用无菌手术剪刀沿着背中线沿着背侧中线切口,在尾部前约两厘米处进行切口。用无菌钳子将切口打开,使用无菌、弯曲、钝尖的手术剪刀,在图中所示的位置之一沿多苏姆形成皮下口袋。
插入剪刀后,打开并关闭刀尖两次,形成足够大的口袋,可以容纳插入的海绵。当口袋被创建时,使用无菌手术剪刀轻轻挤压培养皿中的一块PVA海绵,以去除多余的PBS。接下来,将海绵举到一角,用剪刀抓住的角落,将海绵放入皮下口袋。
当所有六块海绵都放置到证明时,使用无菌钳子将切口的后体皮肤捏在一起,并使用两个不锈钢伤口夹关闭切口。对于PVA海绵液隔离,植入后1至14天,取出手术钉,用牙钳打开切口。使用剪刀沿后沿中线延伸切口,并使用钳子从皮下口袋中提取一块海绵。
将海绵放入嵌套在冰上16毫升培养管中的5毫升注射器桶中,并尽可能用剪刀将粘在海绵表面的任何结缔组织。当所有海绵都提取并转移时,将培养管离心以收集伤口液。为了将细胞从PVA海绵中分离,在收集海绵后,请将它们放入含有5毫升HSS收集介质的15毫升圆锥管中。
收集所有海绵后,将海绵悬浮液放入 80 毫升搅拌机袋中,并将袋子从桨搅拌机的舱口挂上,以便桨能够撞击海绵和介质。将桨式搅拌机设置为高运行 60 秒,然后按"启动"。当搅拌机停止时,挤压袋中的海绵以完全释放介质,并使用移液器将介质从搅拌袋移回 15 毫升管中。
调整桨式搅拌机的设置,在高位置运行 30 秒,并在搅拌袋中添加 5 毫升介质。在离心收集的介质管之前,再重复胃部过程两次。在锥形管底部应可见细胞和红血球的红粒。
将 900 微升蒸馏水与细胞混合三到五秒钟,然后用 100 微升 10x PBS 和 4 毫升 1x PBS 中和中和。通过离心收集细胞,并在适当的介质中重新暂停白细胞颗粒,用于下游分析。为了制造尾皮伤口,在确认对麻醉中对头趾捏缺乏反应后,8至12周大,雄性,C57-Black/6小鼠,使用无菌纱布两次将波维酮碘溶液涂抹到手术现场,随后应用70%乙醇。
使用永久标记和预制模板,在尾部的后面上跟踪 10 到 3 毫米的截面,从尾部底部追踪 10 毫米,然后将鼠标放在无菌手术窗帘上。戴上无菌手术手套,使用无菌手术刀刀片,沿着伤口区域的右、下、左边缘进行全厚切口。使用无菌钳子,将切除的皮肤从尾部剥离,并使用无菌手术剪刀切开伤口区域的上边缘。
使用无菌纱布对伤口施加压力以阻止出血,并在伤口床上涂抹喷雾阻隔膜。然后,以固定的时间间隔从固定距离拍摄伤口,通过平面分析分析照片以确定伤口面积测量结果。PVA海绵植入手术产生全身炎症反应,在受伤一天后在血浆中诱导IL-6就证明了这一点。
可从PVA海绵伤口中恢复的细胞数量随着时间的推移而增加,其中嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞是海绵内主要细胞渗透种群。中性粒细胞被确定为Ly6G阳性,西格尔克-F-阴性细胞。西格尔克-F阳性细胞主要是嗜酸性细胞。
在Ly6G阴性、西格尔克-F阴性细胞上进行加注,可以识别F4/80阳性的单细胞和巨噬细胞。F4/80阳性细胞可以通过其Ly6C表达进一步分化,以区分Ly6C高炎症单细胞和Ly6C低单核细胞衍生巨噬细胞。切除尾皮肤模型提供了一种替代的后体皮肤冲孔活检方法,研究伤口闭合在缺乏密集毛皮的坚定的皮肤。
伤口闭合可以通过测量伤口床的面积来量化。通过H和E和马森的三色染色组织学分析,也可以在横截面观察尾皮伤口。在这些图像中,切除皮肤的横向边距由尾部的支面上的箭头指示。
为了了解稳定状态伤口愈合,治疗化合物或干预也可以测试通过他们直接注射到PVA海绵或通过交付到尾部伤口床。