Bu modeller, hücresel ve sitokin kinetik ve yara kapanması da dahil olmak üzere yara iyileşmesi yanıtının çeşitli yönlerini değerlendirmek için uygulanabilir. PVA sünger modeli, fhenotipik ve fonksiyonel analizler için milyonlarca yara lökositinin kurtarılmasını sağlarken, kuyruk derisi eksizyonu modeli yavaş iyileşen yaraların kolayca görüntülenmesine olanak sağlar. PVA sünger ve eksizyonel kuyruk yarası modelleri, yara iyileşmesi üzerindeki etkilerini anlamak için diyabet veya pnömoni gibi komorbid durumlarla birlikte kullanılabilir.
Meredith Crane'in prosedürlerini gösteren bill Henry olacak, laboratuvarımdan araştırma görevlisi. Deneye başlamadan önce, PVA sünger yapraklarını sekize sekiz x 4 milimetrelik parçalara kesmek için makas kullanın. Otoklav PBS sünger sterilize önce 10 dakika boyunca bir kabın steril PBS sünger parçaları rehydrate.
Süngerler soğuyunca, pbs'ye batırılmış süngerleri dört santigrat derecede saklayın. İşlem günü, steril laminar akış kaputunda steril bir kültür çanağı içine deneysel hayvan başına altı sünger yerleştirin ve anestezik, sekiz ila 12 haftalık, erkek, C57-Siyah/6 fare ayak ucutu tepki eksikliği ni onaylayın. Bir asistan dorsum ve steril gazlı bez boyunca iki kez, tek bir% 70 etanol uygulaması takip povidon-iyot çözeltisi uygulamak için saç kaldırmak için makas kullanın.
Asistan daha sonra fareyi ısıtmalı bir ped üzerine yerleştirilen steril cerrahi perdeler üzerine aktarmalıdır. Steril eldiven ler giyerek, sırt derisini altta yatan dokudan uzaklaştırmak için terlik kullanın ve dorsal orta hat boyunca kuyruk tabanına yaklaşık iki santimetre ön lükte iki santimetrelik bir kesi yapmak için steril cerrahi makas kullanın. Kesiyi steril forsepslerle açık tutarak steril, kavisli, künt uçlu cerrahi makas kullanarak dorsum boyunca şekil deki pozisyonlardan birinde deri altı bir cep oluşturur.
Makas takıldıktan sonra, uçları iki kez açıp kapatın ve içine yerleştirilen süngeri tutacak kadar büyük bir cep oluşturacak şekilde kapatın. Cep oluşturulduğunda, aşırı PBS kaldırmak için kültür çanak hafifçe bir PVA sünger sıkmak için steril cerrahi makas kullanın. Daha sonra, bir köşe ile sünger kaldırın ve, makas tarafından düzenlenen köşe ile lider, deri altı cebine sünger yerleştirin.
Altı süngerin tümü gösterildiği gibi yerleştirildiğinde, kesici dorsal deriyi bir araya getirmek için steril çifenler kullanın ve kesiği iki paslanmaz çelik yara klipsi ile kapatın. PVA sünger sıvı izolasyonu için, implantasyondan 1 ila 14 gün sonra, cerrahi zımbaları çıkarın ve kesiyi dişli forsepslerle açın. Dorsal orta hat boyunca kesi uzatmak için makas kullanın ve deri altı cebinden bir sünger ayıklamak için forceps kullanın.
Süngeri buz üzerinde 16 mililitrelik bir kültür tüpüne yuvalanmış beş mililitrelik şırınganın namlununa yerleştirin ve gerektiğinde süngerin yüzeyine yapışmayan bağ dokusunu ayırmak için makas kullanın. Tüm süngerler çıkarıldığında ve gösterildiği gibi transfer edildiğinde, yara sıvısını toplamak için kültür tüpünü santrifüj edin. PVA süngerhücreleri izole etmek için, az önce gösterildiği gibi süngerleri topladıktan sonra, beş mililitre HBSS toplama ortamı içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.
Tüm süngerler toplandığında, sünger süspansiyonuna 80 mililitrelik bir blender torbasına yerleştirin ve küreklerin süngerlere ve ortama çarpması için çantayı kürek blender'ın kapağına asın. Raket blender'ı 60 saniye boyunca yüksekte çalışacak şekilde ayarlayın ve start tuşuna basın. Blender durduğunda, tamamen orta serbest bırakmak için torbadaki süngersıkmak ve 15 mililitrelik tüp geri blender torbasından orta aktarmak için bir pipet kullanın.
Raket blender ayarlarını yüksek 30 saniye çalıştırmak için ayarlayın ve blender çantası na orta beş mililitre ekleyin. Toplanan ortamın tüpünü santrifüj etmeden önce mide işlemini iki kez daha tekrarlayın. Konik tüpün alt kısmında hücreler ve kırmızı kan hücrelerinin kırmızı bir pelet görünür olmalıdır.
900 mikrolitre distile suyu hücrelerle 3-5 saniye karıştırın ve 10x PBS'nin 100 mikrolitresi ve 1x PBS'nin dört mililitresi ile lysis'i nötralize edin. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve downstream analizi için uygun ortamda beyaz hücre pelet resuspend. Bir kuyruk deri yarası oluşturmak için, anestezi, sekiz-12 haftalık, erkek, C57-Siyah / 6 fare, cerrahi siteye iki kez povidon-iyot solüsyonu uygulamak için steril gazlı bez kullanın, anestezik parmak çimdik yanıt eksikliği doğruladıktan sonra% 70 etanol bir uygulama izledi.
Kalıcı bir işaretleyici ve önceden yapılmış bir şablon kullanarak, kuyruğun sırt yüzeyinde, kuyruk tabanından 10 milimetre uzakta 10'ar üç milimetrelik bir bölüm izleyin ve fareyi steril cerrahi perdelerüzerine yerleştirin. Steril cerrahi eldivenler giyerek, yara alanının sağ, alt ve sol kenarları boyunca tam kalınlıkta bir kesi yapmak için steril bir neşter bıçak kullanın. Steril çöförler kullanarak, kuyruk uzak excised deri soyma ve yara alanının üst kenarı kesmek için steril cerrahi makas kullanın.
Kanamayı durdurmak için yaraya basınç uygulamak için steril gazlı bez kullanın ve yara yatağına bir sprey bariyer filmi uygulayın. Daha sonra, yaraları n düzenli zaman aralıklarında sabit bir mesafeden fotoğraflayın ve yara alanı ölçümlerini belirlemek için planimetrik analiz ile fotoğrafları analiz edin. PVA sünger implantasyon cerrahisi, yaralanmadan bir gün sonra plazmada IL-6 indüksiyonu ile gösterildiği gibi sistemik inflamatuar yanıt oluşturur.
PVA sünger yaralarından kurtarılabilen hücrelerin sayısı zamanla artar, nötrofiller, monositler ve süngerler içinde birincil hücresel infiltrasyon popülasyonları oluşturan makrofajlar ile. Nötrofiller Ly6G-pozitif, Siglec-F-negatif hücreler olarak tanımlanır. Siglec-F-pozitif hücreler öncelikle eozinofillerdir.
Ly6G-negatif, Siglec-F-negatif hücreleri gating F4/80-pozitif monositler ve makrofajlar belirlenmesini sağlar. F4/80-pozitif hücreler Ly6C yüksek inflamatuar monositleri ve Ly6C düşük monosit türetilmiş makrofajları ayırt etmek için Ly6C ekspresyonu ile daha da ayırt edilebilir. Eksizyonel kuyruk deri modeli yoğun kürk eksik firma cilt yara kapanması çalışma dorsal deri yumruk biyopsi yöntemine bir alternatif sağlar.
Yara kapanması zaman içinde yara yatağının alanı ölçülerek ölçülebilir. Kuyruk derisi yarası h ve E ve Masson'un trikrom boyama yoluyla histolojik analiz ile kesitte de görülebilir. Bu görüntülerde, eksire derinin lateral kenar boşlukları kuyruğun sırt yüzeyindeki ok başları ile gösterilir.
Kararlı durumda yara iyileşmeanlamak için, terapötik bileşikler veya müdahaleler de doğrudan PVA sünger içine enjeksiyon yoluyla veya kuyruk yara yatağına teslim yoluyla test edilebilir.
