Diese Modelle können implementiert werden, um verschiedene Aspekte der Wundheilungsreaktion zu bewerten, einschließlich Zell- und Zytokinkinkinkinetik und Wundverschluss. Das PVA-Schwammmodell ermöglicht die Rückgewinnung von Millionen von Wundleukozyten für phänotyptische und funktionelle Analysen, während das Schwanzhautexzisionsmodell die einfache Visualisierung von langsam heilenden Wunden ermöglicht. Die PVA-Schwamm- und Exzisionalschwanzwundenmodelle können in Verbindung mit komorbiden Erkrankungen wie Diabetes oder Lungenentzündung verwendet werden, um deren Auswirkungen auf die Wundheilung zu verstehen.
Die Verfahren mit Meredith Crane demonstrieren Bill Henry, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, schneiden Sie mit einer Schere Blätter aus PVA-Schwamm in acht mal acht mal vier Millimeter große Stücke. Rehydrieren Sie die Schwammstücke in sterilem PBS in einem Becher für 10 Minuten, bevor Autoklav die Schwämme im PBS sterilisiert.
Wenn die Schwämme abgekühlt sind, lagern Sie die in PBS getauchten Schwämme bei vier Grad Celsius. Legen Sie am Tag des Eingriffs sechs Schwämme pro Versuchstier in eine sterile Kulturschale in eine sterile laminare Fließhaube und bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkniff in einer anästhesierten, acht bis 12 Wochen alten, männlichen, C57-Black/6-Maus. Lassen Sie einen Assistenten Clippers verwenden, um das Haar entlang der Dorsum und sterile Gaze zu entfernen, um Povidon-Jod-Lösung auf den rasierten Bereich zweimal auftragen, gefolgt von einer einzigen 70%Ethanol-Anwendung.
Der Assistent sollte dann die Maus auf sterile chirurgische Vorhänge übertragen, die über ein beheiztes Pad gelegt werden. Tragen Sie sterile Handschuhe, verwenden Sie Zangen, um die rückenförmige Haut vom darunter liegenden Gewebe wegzuziehen, und verwenden Sie sterile chirurgische Scheren, um einen zwei Zentimeter großen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie etwa zwei Zentimeter vor der Basis des Schwanzes zu machen. Halten Sie den Schnitt mit steriler Zange offen, verwenden Sie sterile, gekrümmte, stumpfe chirurgische Schere, um eine subkutane Tasche entlang des Dorsums in einer der in der Abbildung angegebenen Positionen zu bilden.
Sobald die Schere eingesetzt wurde, öffnen und schließen Sie die Spitzen zweimal, um eine Tasche zu bilden, die groß genug ist, um einen eingelegten Schwamm zu halten. Wenn die Tasche erstellt wurde, verwenden Sie sterile chirurgische Schere, um sanft einen PVA-Schwamm in der Kulturschale zu drücken, um überschüssige PBS zu entfernen. Als nächstes heben Sie den Schwamm um eine Ecke, und legen Sie den Schwamm mit der Ecke, die von der Schere gehalten wird, in die subkutane Tasche.
Wenn alle sechs Schwämme wie gezeigt platziert wurden, verwenden Sie sterile Zangen, um die eingeschnittene Rückenhaut zusammenzuklemmen, und schließen Sie den Schnitt mit zwei Edelstahl-Wundclips. Für die Isolierung von PVA-Schwammflüssigkeiten entfernen Sie ein bis 14 Tage nach der Implantation die chirurgischen Klammern und öffnen Sie den Schnitt mit Zahnzangen. Verwenden Sie eine Schere, um den Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie zu verlängern, und verwenden Sie Zangen, um einen Schwamm aus seiner subkutanen Tasche zu extrahieren.
Legen Sie den Schwamm in den Lauf einer Fünf-Milliliter-Spritze, die in einem 16-Milliliter-Kulturrohr verschachtelt ist, auf Eis und entfernen Sie mit einer Schere jedes Bindegewebe, das bei Bedarf an der Oberfläche des Schwamms haftet. Wenn alle Schwämme extrahiert und übertragen wurden, wie gezeigt, zentrifugieren Sie das Kulturrohr, um die Wundflüssigkeit zu sammeln. Um die Zellen von den PVA-Schwämmen zu isolieren, legen Sie sie nach dem Sammeln der Schwämme, wie gerade gezeigt, in ein 15-Milliliter konisches Rohr mit fünf Millilitern HBSS-Sammelmedium.
Wenn alle Schwämme gesammelt sind, dekantieren Sie die Schwammfederung in einen 80-Milliliter-Mixerbeutel und hängen Sie den Beutel aus der Luke des Paddelmixers auf, so dass die Paddel die Schwämme und das Medium treffen. Stellen Sie den Paddelmixer auf hoch für 60 Sekunden, und drücken Sie Start. Wenn der Mixer angehalten hat, drücken Sie die Schwämme in den Beutel, um das Medium vollständig freizugeben, und verwenden Sie eine Pipette, um das Medium aus dem Mixerbeutel zurück in das 15-Milliliter-Rohr zu übertragen.
Passen Sie die Einstellungen des Paddelmixers so an, dass er 30 Sekunden lang hoch läuft, und fügen Sie dem Mixerbeutel fünf Milliliter Medium hinzu. Wiederholen Sie den Magenprozess zwei weitere Male, bevor Sie das Rohr des gesammelten Mediums zentrieren. Ein rotes Pellet aus Zellen und roten Blutkörperchen sollte an der Unterseite des konischen Röhrchens sichtbar sein.
Mischen Sie 900 Mikroliter destilliertes Wasser mit den Zellen für drei bis fünf Sekunden, bevor Sie die Lyse mit 100 Mikrolitern 10x PBS und vier Milliliter 1x PBS neutralisieren. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, und setzen Sie das weiße Zellpellet im geeigneten Medium für die nachgelagerte Analyse wieder aus. Um eine Schwanzhautwunde zu erstellen, nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung in der anästhesierten, acht bis 12 Wochen alten, männlichen, C57-Black/6 Maus, verwenden Sie sterile Gaze, um Povidon-Jod-Lösung zweimal auf die chirurgische Stelle aufzutragen, gefolgt von einer Anwendung von 70%Ethanol.
Verfolgen Sie mit einem permanenten Marker und einer vorgefertigten Schablone einen 10 mal drei Millimeter großen Abschnitt auf der Dorsaloberfläche des Schwanzes, 10 Millimeter von der Schwanzbasis entfernt, und legen Sie die Maus auf sterile chirurgische Vorhänge. Verwenden Sie sterile chirurgische Handschuhe, verwenden Sie eine sterile Skalpellklinge, um einen Schnitt mit voller Dicke entlang der rechten, unteren und linken Ränder des Wundbereichs zu machen. Mit sterilen Zangen, schälen Sie die ausgeschnittene Haut weg vom Schwanz, und verwenden Sie sterile chirurgische Schere, um den oberen Rand des Wundbereichs zu schneiden.
Verwenden Sie sterile Gaze, um Druck auf die Wunde auszuüben, um die Blutung zu stoppen, und wenden Sie einen Sprühbarrierefilm auf das Wundbett an. Fotografieren Sie dann die Wunden in regelmäßigen Zeitabständen aus einem festen Abstand und analysieren die Fotos durch planimetrische Analyse, um die Wundbereichsmessungen zu bestimmen. Die PVA-Schwammimplantationschirurgie erzeugt eine systemische Entzündungsreaktion, wie die Induktion von IL-6 im Plasma einen Tag nach der Wundwunde zeigt.
Die Anzahl der Zellen, die aus PVA-Schwammwunden zurückgewonnen werden können, nimmt mit der Zeit zu, mit Neutrophilen, Monozyten und Makrophagen, die die primären zellulären infiltrierenden Populationen innerhalb der Schwämme umfassen. Neutrophile werden als Ly6G-positive, Siglec-F-negative Zellen identifiziert. Siglec-F-positive Zellen sind in erster Linie Eosinophile.
Die Angating auf den Ly6G-negativen, Siglec-F-negativen Zellen ermöglicht die Identifizierung von F4/80-positiven Monozyten und Makrophagen. F4/80-positive Zellen können durch ihre Ly6C-Expression weiter differenziert werden, um Ly6C hochentzündliche Monozyten und Ly6C-niedrige Monozyten-abgeleitete Makrophagen zu unterscheiden. Das exzisionale Schwanzhautmodell bietet eine Alternative zur dorsalen Hautpunschbiopsiemethode, um den Wundverschluss in fester Haut ohne dichtes Fell zu untersuchen.
Der Wundverschluss kann quantifiziert werden, indem der Bereich des Wundbettes im Laufe der Zeit gemessen wird. Die Schwanzhautwunde kann auch im Querschnitt durch histologische Analyse über H und E und Massons trichrome Färbung beobachtet werden. In diesen Bildern werden die seitlichen Ränder der ausgeschnittenen Haut durch die Pfeilspitzen auf der Dorsaloberfläche des Schwanzes angezeigt.
Um die stationäre Wundheilung zu verstehen, können therapeutische Verbindungen oder Interventionen auch durch ihre Injektion direkt in den PVA-Schwamm oder durch Lieferung an das Schwanzwundbett getestet werden.
