これらのモデルは、細胞およびサイトカイン動態および創傷閉鎖を含む創傷治癒応答の様々な側面を評価するために実施することができる。PVAスポンジモデルは、表現型および機能的分析のための何百万もの創傷白血球の回収を可能にし、尾部皮膚切除モデルはゆっくりと治癒する創傷を容易に視覚化することを可能にする。PVAスポンジおよび切除テール創傷モデルは、糖尿病や肺炎などの併存疾患と組み合わせて使用して、創傷治癒への影響を理解することができます。
メレディス・クレーンとの手順を実証することは、私の研究室の研究アシスタントであるビル・ヘンリーです。実験を始める前に、はさみを使ってPVAスポンジのシートを8×8×4ミリメートルにカットします。PBS内のスポンジを殺菌する前に、ビーカーで滅菌PBS中のスポンジ片を10分間水分補給します。
スポンジが冷えたら、PBSに沈んだスポンジを摂氏4度で保管してください。手順の日に、滅菌層流れフードに無菌培養皿に実験動物ごとに6つのスポンジを置き、麻酔を受けた8〜12週齢の男性C57-Black/6マウスでつま先ピンチに対する応答の欠如を確認します。アシスタントは、ドーサムと滅菌ガーゼに沿って髪を除去するためにバリカンを使用して、ポビドネ-ヨウ素溶液を剃った領域に2回塗布し、続いて単一の70%エタノール塗布を行います。
助手は、加熱されたパッドの上に置かれた無菌外科ドレープにマウスを移す必要があります。無菌手袋を着用し、下地の組織から後部皮膚を引き離すために鉗子を使用し、滅菌手術用はさみを使用して、尾部の基部に約2センチメートル前部の後方正中線に沿って2センチメートルの切開を行う。無菌鉗子で切開を開いたままにして、無菌、湾曲した、鈍い先端の外科用はさみを使用して、図に示すように、ドーサムに沿って皮下ポケットを形成する。
はさみを挿入したら、チップを2回開閉して、挿入したスポンジを保持するのに十分な大きさのポケットを形成します。ポケットが作成されたら、無菌手術用はさみを使用して、培養皿の1つのPVAスポンジを静かに絞って余分なPBSを取り除きます。次に、スポンジを片隅に持ち上げ、ハサミで角を曲げて、スポンジを皮下ポケットに入れます。
6つのスポンジがすべて実証されているように配置されたら、無菌鉗子を使用して切開後部皮膚をつまみ、2つのステンレススチール製の巻きクリップで切開を閉じます。PVAスポンジ液の分離のために、移植後1〜14日後、外科用ステープルを取り除き、歯付き鉗子で切開を開く。はさみを使用して後部中線に沿って切開を延長し、鉗子を使用して皮下ポケットからスポンジを1本抽出します。
氷の上の16ミリリットルの培養チューブにネストされた5ミリリットルのシリンジのバレルにスポンジを置き、必要に応じてスポンジの表面に付着したままの結合組織を切り離すためにはさみを使用します。すべてのスポンジが抽出され、実証されるように移管された場合、培養管を遠心分離して創傷液を採取する。PVAスポンジから細胞を分離するには、ちょうど実証したようにスポンジを採取した後、5ミリリットルのHBSS採取媒体を含む15ミリリットルの円錐管に入れる。
すべてのスポンジが収集されたら、スポンジサスペンションを80ミリリットルのブレンダーバッグにデカントし、パドルがスポンジと媒体に当たるようにパドルブレンダーのハッチからバッグを掛けます。パドルブレンダーを60秒間高く走るように設定し、startを押します。ブレンダーが停止したら、袋の中のスポンジを絞って培地を完全に放出し、ピペットを使用してブレンダーバッグから15ミリリットルのチューブに培地を戻します。
パドルブレンダーの設定を調整して高い30秒間実行し、ブレンダーバッグに5ミリリットルのミディアムを追加します。収集した培地のチューブを遠心する前に、さらに2回胃の培養を繰り返します。細胞と赤血球の赤いペレットは、円錐管の下部に表示される必要があります。.
蒸留水900マイクロリットルを細胞と3~5秒間混合してから、100マイクロリットルの100マイクロリットルのPBSと1x PBSの4ミリリットルで溶菌を中和します。遠心分離によって細胞を収集し、下流分析のために適切な媒体中の白い細胞ペレットを再懸濁する。尾部皮膚創傷を作成するには、麻酔下でつま先ピンチへの応答の欠如を確認した後、8〜12週齢、男性、C57-Black/6マウス、生殖不能ガーゼを使用してポビドネヨウ素溶液を手術部位に2回塗布し、続いて70%エタノールを1回塗布する。
永久的なマーカーとあらかじめ作られたテンプレートを使用して、尾の裏面、尾のベースから10ミリメートルの上に10×3ミリメートルのセクションをトレースし、無菌外科ドレープの上にマウスを置きます。無菌の外科用手袋を着用し、無菌メスの刃を使用して、創傷領域の右、下、および左端に沿って完全な厚さの切開を行います。滅菌鉗子を使用して、切除された皮膚を尾から剥がし、生殖不能の外科用はさみを使用して創傷領域の上端を切り取る。
滅菌ガーゼを使用して、出血を止めるために傷口に圧力をかけ、創傷床にスプレーバリアフィルムを塗布する。次に、一定の間隔で一定の距離から創傷を撮影し、平面解析により写真を解析し、創傷面積の測定値を決定する。PVAスポンジ移植手術は、創傷の翌日に血漿中のIL-6の誘導によって示されるように、全身的な炎症反応を生成する。
PVAスポンジ創傷から回収できる細胞の数は、スポンジ内の一次細胞浸潤集団を含む好中球、単球、およびマクロファージで、時間の経過とともに増加する。好中球はLy6G陽性、シグレック-F陰性細胞として同定される。シグレク-F陽性細胞は主に好酸球である。
Ly6G陰性のシグレック-F陰性細胞のGAT化により、F4/80陽性単球およびマクロファージの同定が可能となる。F4/80陽性細胞は、Ly6Cの発現によりさらに分化し、Ly6C高炎症性単球とLy6C低単球由来マクロファージを区別することができる。切除尾皮膚モデルは、密な毛皮を欠く堅い皮膚の創傷閉鎖を研究する後部皮膚パンチ生検法に代わるものを提供する。
創傷閉鎖は、創傷床の面積を時間の経過とともに測定することによって定量することができる。尾の皮膚の創傷はまた、HとEとマッソンのトリクロム染色を介して組織学的分析によって断面で観察することができる。これらの画像では、切除された皮膚の横方向のマージンは、尾の後ろ面の矢印によって示されています。
定常性創傷治癒を理解するために、治療化合物または介入はまた、PVAスポンジへの直接注入または尾創床への送達を通じて試験することができる。
