Esses modelos podem ser implementados para avaliar vários aspectos da resposta de cicatrização da ferida, incluindo cinética celular e citocina e fechamento da ferida. O modelo de esponja PVA permite a recuperação de milhões de leucócitos de feridas para análises fenotípicas e funcionais, enquanto o modelo de excisão da pele da cauda permite a fácil visualização de feridas de cicatrização lenta. Os modelos de esponja PVA e ferida traseira excisional podem ser usados em conjunto com condições comorbas, como diabetes ou pneumonia, para entender seu impacto na cicatrização da ferida.
Demonstrando os procedimentos com Meredith Crane estará Bill Henry, um assistente de pesquisa do meu laboratório. Antes de iniciar o experimento, use uma tesoura para cortar folhas de esponja PVA em pedaços de oito por oito por quatro milímetros. Reidratar as peças de esponja em PBS estéril em um béquer por 10 minutos antes de autoclave esterilizar as esponjas na PBS.
Quando as esponjas esfriarem, armazene as esponjas submersas na PBS a quatro graus Celsius. No dia do procedimento, coloque seis esponjas por animal experimental em um prato de cultura estéril em um capô de fluxo laminar estéril, e confirme a falta de resposta para beliscar o dedo do pé em um rato anestesiado, de oito a 12 semanas de idade, macho, C57-Black/6. Tenha um assistente usar cortadores para remover o cabelo ao longo do dorso e gaze estéril para aplicar solução povidone-iodo na área raspada duas vezes, seguido por uma única aplicação de 70% de etanol.
Em seguida, o assistente deve transferir o mouse para cortinas cirúrgicas estéreis colocadas sobre uma almofada aquecida. Usando luvas estéreis, use fórceps para puxar a pele dorsal para longe do tecido subjacente, e use uma tesoura cirúrgica estéril para fazer uma incisão de dois centímetros ao longo da linha dorsal aproximadamente dois centímetros antes da base da cauda. Mantendo a incisão aberta com fórceps estéreis, use tesoura cirúrgica estéril, curva, com ponta bruta para formar um bolso subcutâneo ao longo do dorso em uma das posições indicadas na figura.
Uma vez que a tesoura tenha sido inserida, abra e feche as pontas duas vezes para formar um bolso grande o suficiente para segurar uma esponja inserida. Quando o bolso tiver sido criado, use uma tesoura cirúrgica estéril para espremer suavemente uma esponja PVA no prato de cultura para remover o excesso de PBS. Em seguida, levante a esponja por um canto, e, levando com o canto segurado pela tesoura, coloque a esponja no bolso subcutâneo.
Quando todas as seis esponjas tiverem sido colocadas como demonstrado, use fórceps estéreis para beliscar a pele dorsal incisada e fechar a incisão com dois clipes de aço inoxidável. Para isolamento do fluido de esponja PVA, de um a 14 dias após a implantação, remova os grampos cirúrgicos e abra a incisão com fórceps dentados. Use uma tesoura para estender a incisão ao longo da linha média dorsal, e use fórceps para extrair uma esponja de seu bolso subcutâneo.
Coloque a esponja no cano de uma seringa de cinco mililitros aninhada em um tubo de cultura de 16 mililitros no gelo, e use uma tesoura para desassociar qualquer tecido conjuntivo que permaneça aderente à superfície da esponja, conforme necessário. Quando todas as esponjas tiverem sido extraídas e transferidas como demonstrado, centrifufique o tubo de cultura para coletar o fluido da ferida. Para isolar as células das esponjas PVA, depois de coletar as esponjas como apenas demonstrado, coloque-as em um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de meio de coleta HBSS.
Quando todas as esponjas tiverem sido coletadas, decante a suspensão da esponja em um saco de liquidificador de 80 mililitros, e pendure o saco da escotilha do liquidificador de pás para que as pás atinjam as esponjas e o meio. Coloque o liquidificador de remo para funcionar em alta por 60 segundos e pressione a partida. Quando o liquidificador parar, aperte as esponjas no saco para liberar completamente o meio e use uma pipeta para transferir o meio do saco do liquidificador de volta para o tubo de 15 mililitros.
Ajuste as configurações do liquidificador de remo para funcionar por 30 segundos no alto e adicione cinco mililitros de médio ao saco do liquidificador. Repita o processo de estômago mais duas vezes antes de centrifugar o tubo do meio coletado. Uma pelota vermelha de células e glóbulos vermelhos deve ser visível na parte inferior do tubo cônico.
Misture 900 microliters de água destilada com as células por três a cinco segundos antes de neutralizar a lise com 100 microliters de PBS 10x e quatro mililitros de 1x PBS. Colete as células por centrifugação e resuspenque a pelota de célula branca no meio apropriado para análise a jusante. Para criar uma ferida de pele da cauda, depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé no anesthetizado, de oito a 12 semanas de idade, macho, C57-Black/6 mouse, use gaze estéril para aplicar solução povidone-iodo duas vezes ao local cirúrgico, seguido por uma aplicação de 70% de etanol.
Usando um marcador permanente e um modelo pré-feito, rastreie uma seção de 10 por três milímetros na superfície dorsal da cauda, a 10 milímetros da base traseira, e coloque o rato em cortinas cirúrgicas estéreis. Usando luvas cirúrgicas estéreis, use uma lâmina de bisturi estéril para fazer uma incisão de espessura total ao longo das bordas direita, inferior e esquerda da área da ferida. Usando fórceps estéreis, retire a pele excisada da cauda e use uma tesoura cirúrgica estéril para cortar a borda superior da área da ferida.
Use gaze estéril para aplicar pressão na ferida para parar de sangrar, e aplique uma película de barreira de spray no leito da ferida. Em seguida, fotografe as feridas a uma distância fixa em intervalos de tempo regulares e analise as fotografias por análise planimétrica para determinar as medidas da área da ferida. A cirurgia de implantação de esponja PVA gera uma resposta inflamatória sistêmica, como demonstrado pela indução de IL-6 no plasma um dia após o ferimento.
O número de células que podem ser recuperadas de feridas de esponja PVA aumenta ao longo do tempo, com neutrófilos, monócitos e macrófagos que compreendem as populações primárias de infiltração celular dentro das esponjas. Os neutrófilos são identificados como células Ly6G-positive, Siglec-F-negativos. As células siglec-f-positivas são principalmente eosinófilos.
Gating nas células Ly6G-negativos, Siglec-F-negativo permite a identificação de monócitos e macrófagos F4/80 positivos. As células F4/80 positivas podem ser ainda mais diferenciadas por sua expressão Ly6C para distinguir monócitos inflamatórios elevados e macrófagos derivados de monócitos Ly6C. O modelo de pele da cauda excisional fornece uma alternativa ao método de biópsia dorsal do soco da pele para estudar o fechamento da ferida na pele firme sem pele densa.
O fechamento da ferida pode ser quantificado medindo a área do leito de ferida ao longo do tempo. A ferida da pele da cauda também pode ser observada em seção transversal por análise histológica via H e E e a coloração tricrômica de Masson. Nestas imagens, as margens laterais da pele excisada são indicadas pelas pontas das flechas na superfície dorsal da cauda.
Para entender a cicatrização de feridas de estado estável, compostos terapêuticos ou intervenções também podem ser testados através de sua injeção diretamente na esponja PVA ou através da entrega ao leito da ferida da cauda.
