Questi modelli possono essere implementati per valutare vari aspetti della risposta di guarigione delle ferite, tra cui cinetica cellulare e citochina e chiusura delle ferite. Il modello di spugna PVA consente il recupero di milioni di leucociti ferita per analisi fenotipiche e funzionali, mentre il modello di escissione della pelle della coda consente una facile visualizzazione delle ferite a lenta guarigione. La spugna PVA e i modelli di ferita da coda escisionali possono essere utilizzati in combinazione con condizioni di comorbilità, come diabete o polmonite, per comprendere il loro impatto sulla guarigione delle ferite.
A dimostrare le procedure con Meredith Crane sarà Bill Henry, un assistente di ricerca del mio laboratorio. Prima di iniziare l'esperimento, utilizzare le forbici per tagliare fogli di spugna PVA in pezzi otto per otto per quattro millimetri. Reidratare i pezzi di spugna in PBS sterile in un bicchiere per 10 minuti prima dell'autoclave sterilizzando le spugne nel PBS.
Quando le spugne si sono raffreddate, conservare le spugne immerse in PBS a quattro gradi Celsius. Il giorno della procedura, posizionare sei spugne per animale sperimentale in un piatto di coltura sterile in un cappuccio sterile a flusso laminare e confermare la mancanza di risposta al dito del dito in un topo anestetizzato, di otto-12 settimane, maschio, C57-Nero / 6. Chiedere a un assistente di utilizzare le tosatrici per rimuovere i capelli lungo il dorsum e la garza sterile per applicare due volte la soluzione di povidone-iodio all'area rasata, seguita da una singola applicazione al 70% di etanolo.
L'assistente deve quindi trasferire il mouse su tende chirurgiche sterili posizionate su un tampone riscaldato. Indossando guanti sterili, utilizzare le flessione per allontanare la pelle dorsale dal tessuto sottostante e utilizzare forbici chirurgiche sterili per fare un'incisione di due centimetri lungo la linea mediana dorsale di circa due centimetri anteriore alla base della coda. Tenendo aperta l'incisione con forcep sterili, utilizzare forbici chirurgiche sterili, curve e con punta smussata per formare una tasca sottocutanea lungo il dorsum in una delle posizioni indicate nella figura.
Una volta inserite le forbici, aprire e chiudere le punte due volte per formare una tasca abbastanza grande da contenere una spugna inserita. Una volta creata la tasca, utilizzare forbici chirurgiche sterili per spremere delicatamente una spugna PVA nel piatto di coltura per rimuovere il PBS in eccesso. Successivamente, sollevare la spugna di un angolo e, conducendo con l'angolo tenuto dalle forbici, posizionare la spugna nella tasca sottocutanea.
Quando tutte e sei le spugne sono state posizionate come dimostrato, utilizzare forcep sterili per pizzicare la pelle dorsale incentrata insieme e chiudere l'incisione con due clip avvolte in acciaio inossidabile. Per l'isolamento del fluido della spugna PVA, da uno a 14 giorni dopo l'impianto, rimuovere le graffette chirurgiche e aprire l'incisione con pinza denta. Usa le forbici per estendere l'incisione lungo la linea mediana dorsale e usa le forcep per estrarre una spugna dalla tasca sottocutanea.
Posizionare la spugna nella canna di una siringa da cinque millilitri annidata in un tubo di coltura da 16 millilitri sul ghiaccio e utilizzare le forbici per dissociare qualsiasi tessuto connettivo che rimane aderente alla superficie della spugna, se necessario. Quando tutte le spugne sono state estratte e trasferite come dimostrato, centrifugare il tubo di coltura per raccogliere il fluido della ferita. Per isolare le cellule dalle spugne PVA, dopo aver raccolto le spugne come appena dimostrato, posizionarle in un tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di supporto di raccolta HBSS.
Una volta raccolte tutte le spugne, decantare la sospensione della spugna in un sacchetto frullatore da 80 millilitri e appendere la borsa dal portello del frullatore a pale in modo che le pale colpiscino le spugne e il mezzo. Impostare il frullatore a pale in modo che sia alto per 60 secondi e premere start. Quando il frullatore si è fermato, spremere le spugne nella borsa per rilasciare completamente il mezzo e utilizzare una pipetta per trasferire il mezzo dal sacchetto del frullatore nel tubo da 15 millilitri.
Regolare le impostazioni del frullatore a pale per correre per 30 secondi in alto e aggiungere cinque millilitri di mezzo alla borsa del frullatore. Ripetere il processo di stomaco altre due volte prima di centrifugare il tubo del mezzo raccolto. Un pellet rosso di cellule e globuli rossi dovrebbe essere visibile nella parte inferiore del tubo conico.
Mescolare 900 microlitri di acqua distillata con le cellule per tre o cinque secondi prima di neutralizzare la llisi con 100 microlitri di 10x PBS e quattro millilitri di 1x PBS. Raccogliere le cellule per centrifugazione e rimosogliere il pellet di cellule bianche nel mezzo appropriato per l'analisi a valle. Per creare una ferita alla pelle della coda, dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi nell'anestetizzato, da otto a 12 settimane, maschio, topo C57-Black/6, utilizzare una garza sterile per applicare la soluzione di povidone-iodio due volte al sito chirurgico, seguita da un'applicazione del 70% di etanolo.
Usando un marcatore permanente e un modello prefabbroto, traccia una sezione di 10 per tre millimetri sulla superficie dorsale della coda, a 10 millimetri dalla base della coda, e posiziona il mouse su tende chirurgiche sterili. Indossando guanti chirurgici sterili, utilizzare una lama di bisturi sterile per fare un'incisione a pieno spessore lungo i bordi destro, inferiore e sinistro dell'area della ferita. Usando forcep sterili, rimuovere la pelle asportata dalla coda e utilizzare forbici chirurgiche sterili per tagliare il bordo superiore dell'area della ferita.
Utilizzare una garza sterile per applicare pressione sulla ferita per interrompere il sanguinamento e applicare una pellicola barriera spray sul letto della ferita. Quindi, fotografare le ferite da una distanza fissa a intervalli di tempo regolari e analizzare le fotografie mediante analisi planimetrica per determinare le misurazioni dell'area della ferita. La chirurgia implantare della spugna PVA genera una risposta infiammatoria sistemica, come dimostrato dall'induzione di IL-6 nel plasma un giorno dopo il mento.
Il numero di cellule che possono essere recuperate dalle ferite di spugna del PVA aumenta nel tempo, con neutrofili, monociti e macrofagi che comprendono le popolazioni primarie di infiltrazione cellulare all'interno delle spugne. I neutrofili sono identificati come cellule ly6G-positive, Siglec-F-negative. Le cellule siglec-F-positive sono principalmente eosinofili.
Gating sulle cellule Ly6G-negative, Siglec-F-negative permette l'identificazione di monociti e macrofagi F4/80-positivi. Le cellule F4/80-positive possono essere ulteriormente differenziate dalla loro espressione Ly6C per distinguere i monociti infiammatori ad alto contenuto di Ly6C e i macrofagi derivati da monociti Ly6C. Il modello di pelle della coda escisionale fornisce un'alternativa al metodo di biopsia del pugno dorsale della pelle per studiare la chiusura delle ferite in pelle soda priva di pelliccia densa.
La chiusura della ferita può essere quantificata misurando l'area del letto della ferita nel tempo. La ferita della pelle della coda può anche essere osservata nella sezione trasversale mediante analisi istologiche attraverso la colorazione tricroma di H ed E e Masson. In queste immagini, i margini laterale della pelle accisa sono indicati dalle punte delle frecce sulla superficie dorsale della coda.
Per comprendere la guarigione delle ferite allo stato stazionario, i composti terapeutici o gli interventi possono anche essere testati attraverso la loro iniezione direttamente nella spugna PVA o attraverso la consegna al letto della ferita della coda.
