用于阴道内艾滋病毒暴露和艾滋病毒感染的人性化 NOG 小鼠

建立这种人性化的小鼠模型有助于临床前HIV研究。例如，可以评估不同的病毒株和新的艾滋病毒干预措施。这些协议可用于评估干细胞捐献者CCR5变异状态，有效感染艾滋病病毒的人类小鼠，并量化小鼠血浆病毒载量。

RNA定量协议可以很容易地适应，以量化任何病毒RNA选择序列，在血浆样品中可检测到。用于CCR5增量32变种脐带血样的基因筛选，用含有200微摩尔dNTP混合物的11.25微升，孵育1.25微升非颗粒流，每微升0.01单位高保真DNA聚合酶，以及表中详述的向前和反向等素。将无核酸酶水的体积调整到每个 PCR 反应的大约 12.5 微升，并像表中所示的 PCR 循环程序放大基因组片段。

在反应结束时，将PCR产品分离到2%的加糖凝胶上。来自野生型等位基因和增量32等位基因的PCR产品分别产生196个碱基对和164个碱基对的PCR片段，使带状容易通过凝胶电泳区分。对于阴道内艾滋病毒暴露，将加热灯聚焦在鼠标将位于工作区的中心，并将无菌的 20 微升移液器尖端放入适当的移液器中。

将装有液体消毒剂的容器放入发动机罩中，以便立即使任何与病毒接触的材料和液体失活。将麻醉鼠标放在灯下超置位置的无菌蓝色垫上，鼠标的尾部朝向发动机罩的背面，并确认鼠标对踏板反射缺乏响应。抓住尾巴底部的动物。

轻轻抬起鼠标的尾底，支持动物在倒置直立的位置。使用无菌管尖刺激生殖器区域，轻轻朝肛门抚摸，诱导直肠排空，并减轻对阴道的压力。要暴露阴道开口，小心地将鼠标尾部包裹在手指上，使外阴自然打开。

使用新的移液器尖端，将尖端放在阴道开口的水平，并创伤释放20微升的病毒到阴道，让重力拉病毒悬浮液进入阴道。当所有病毒都传递后，将鼠标保留在此位置五分钟，以避免重力引起的病毒泄漏。然后，小心地将鼠标返回到其主笼中，并监控直至完全恢复。

要将RNA从解冻的小鼠血浆样本中分离出，请根据制造商的说明使用病毒RNA分离试剂盒。添加绑定到柱的样品，并添加列DNase处理步骤，以确保去除血浆样品内的所有DNA。然后在80摄氏度下储存RNA样品至少一小时。

要合成cDNA，根据标准方案使用逆转录酶，在cDNA反应中包括0.5微升的RNase抑制剂，以避免RNA降解，然后执行cDNA合成，详见表中详述，并在80摄氏度下储存cDNA样品至少一小时。为准备 ddPCR 样品，请将含有聚合酶和 dNTP 的 11 微升 ddPCR 探针反应混合物与 250 纳米摩尔的次要槽结合探针和 900 纳米摩尔的每个前进和反向底转混合，如表中所示。添加每个 cDNA 样品的三微升，并将总 PCR 体积调整为 22 微升，并不含核酸酶水。

根据制造商的协议，使用液滴生成油在液滴发生器上进行探头，以乳化 PCR 混合物。然后运行表中概述的 PCR 程序。如表所示，在确认艾滋病毒感染后，用外部供应商准备的含有标准cART方案的颗粒喂养小鼠。

使用红色cART饮食，很容易区分它与普通鼠标周，并使用控制周饮食没有cART在标准棕色。为开始治疗，将含CART的周饮食放入无菌笼中，然后再将小鼠从旧笼转移到新笼中。然后监测小鼠的重量，每天检查含有CART的周的消费，以确保小鼠适应变化。

这里描述了用于分析干细胞纯度的流动细胞仪浇注策略，分离的CD34阳性干细胞的纯度通常介于85%至95%之间，而T细胞污染小于1%。PCR 分析显示纯化供体干细胞的 CCR5 变异状态，使 CCR5 增量 32 异质体供体供体易于识别。在19个捐赠者中，突变基因型的频率约为15.8%，与斯堪的纳维亚人口大型流行病学研究一致。

三至五个月后，采用将7.5倍10至第4个人类CD45阳性细胞转移到受助小鼠体内，从受助动物外周血样本中回收的白血球中，有20%至50%为人类CD45阳性细胞，小鼠将发展出人类B和T细胞。64%的小鼠在阴道暴露后感染HIV，如所示。在改用含有标准 cART 的 40 天饮食后四周，HIV 阳性小鼠的病毒载量会低于检测限值。

停止饮食后，病毒反弹，反映临床数据。重要的是，在cART上的老鼠能很好地忍受饮食的变化。必须记住，这些动物是免疫缺陷，因此容易受到环境的影响。

坚持无菌技术将增加整体动物健康和协议的成功。在建立用于HIV感染的人性化小鼠队列后，该协议可适用于组织中的病毒RNA定量或测试不同病毒株的新干预措施。人类化小鼠在艾滋病毒感染研究方面的灵活性和可及性，使艾滋病毒病毒学、免疫学和治疗研究取得了重大进展。

在尝试涉及传染性艾滋病毒的协议之前，请务必获得当地工作环境官员的批准，并遵守经批准的净化程序。