生物材料膜上人与羊角膜内皮细胞层的生长

此细胞培养协议旨在防止角膜内皮细胞在隔离、扩张和亚培养期间经历上皮到中层过渡。细胞培养物由角膜组织外植物建立，可重复使用，以确保从一个捐赠者持续供应原细胞。首先，使用制造商的说明，用附件因子为六孔组织培养板的孔涂上涂层。

然后向每个编码良好的培养介质添加一毫升的培养介质。将角膜内皮面向上放入解剖显微镜的舞台上的无菌培养皿中。调整照明，使角膜表面照明良好，具有足够的对比度，以突出内皮层，并调整变焦，使边缘和一些中央角膜内皮在视图中。

使用灭菌制表器钳子轻轻地将 Descemet 的膜从底层频闪中提起并撕裂。将膜条放入培养板的准备孔之一，确保立即更换板盖，以降低污染风险。首先从内皮的极端边缘取出 Descemet 膜条，然后从中心区域取出，将一个角膜的所有条状物放入一个孔中。

完成后，在加湿细胞培养孵化器中孵育出的植物设定为37摄氏度和5%的二氧化碳。将微型博伊登室的上室组装，将红色 O 环放入其中心。使用直径为 18 毫米的树外，从 PTFE 切割板上的生物材料片中打出圆盘。

然后，将磁盘放在微型博伊登室的上室的红色 O 环上。将下腔拧到上腔室上，将生物材料的盘固定在两者之间。将组装好的微型博伊登腔室浸泡在70%乙醇中一小时，进行消毒。

浸泡后，将腔室完全浸入无菌的HSSS中10分钟，取出乙醇。然后用培养介质清洗腔室10分钟。并转移到六井板井内的培养介质，确保上室朝向。

调整介质的水平，使介质接触生物材料膜的下表面，但不会流入上室。将100微升细胞悬浮液移入膜中，放入微型博伊登腔室，并在组织培养培养箱中孵育4小时，然后加入介质完全淹没腔室。大多数从一至两岁绵羊的角膜或小于30岁的人类捐赠者身上衍生出的植物，附着在一周内附着在附着因子编码的组织培养板上。

六周后，许多小而密闭的细胞出现在外植体旁边。角膜内皮细胞培养中的小型、紧密包装的细胞对三重消化具有抵抗力，而较大的成纤维细胞则对消化更敏感。这种差异被利用来选择性地从培养物中去除大细胞，然后再将较小的细胞转移到新的细胞中。

对角膜内皮细胞培养物进行了免疫粉化分析，以找到ZO-1，一种紧密结蛋白，和N-卡德林，一种粘结蛋白。同样的抗体用于绵羊和人类细胞，在这两种细胞的血浆膜中检测到这两种蛋白质。定制的微型博伊登腔室允许膜的两侧同时用作细胞培养表面。

组织工程细胞构造的横截面视图显示一个表面上的角膜内皮细胞的单层，另一个表面的角膜状细胞的多层培养。尝试此协议时，当您将 Descemet 的膜从角膜上剥去时，避免用钳子刮除内皮非常重要。按照此过程，可以通过测量膜上的角膜内皮细胞层的完整性来测量其电阻。