Bu hücre kültürü protokolü, kornea endotel hücrelerinin izolasyon, genişleme ve alt kültür sırasında epitelden mezenkimal geçişe girmesini önlemek için tasarlanmıştır. Hücre kültürleri kornea doku eksplants kurulur, hangi bir donör birincil hücrelerin sürekli kaynağı sağlamak için yeniden kullanılabilir. Üreticinin talimatları kullanarak ek faktörü ile altı kuyudoku kültür plakası kuyuları kaplama ile başlayın.
Sonra her iyi kodlanmış kültür orta bir mililitre ekleyin. Kornea endotel tarafını, bir diseksiyon mikroskobu niçin steril bir Petri kabına yerleştirin. Endüste yüzeyinin endotel tabakasını vurgulamak için yeterli kontrastla iyi aydınlatılmış olması için aydınlatmayı ayarlayın ve kenar ın ve bazı merkezi kornea endotelgörünümünü sağlayacak şekilde yakınlaştırmayı ayarlayın.
Descemet'in membranını altta yatan stromadan yavaşça kaldırmak ve yırtmak için sterilize edilmiş saat çicitlerini kullanın. Membran şeridini kültür plakasının hazırlanmış kuyularından birine yerleştirin ve kontaminasyon riskini azaltmak için plakanın kapağını hemen değiştirmeyi unutmayın. Descemet'in zarının şeritlerini önce endotel'in aşırı çevresinden ve daha sonra orta bölgelerden çıkararak bir korneadaki tüm şeritleri tek bir kuyuya yerleştirin.
Bittiğinde, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit ayarlanmış nemlendirilmiş hücre kültürü kuluçka ekskütif. Mikro Boyden odasının üst odasını, ortasına kırmızı bir O halkası yerleştirerek birleştirin. PTFE kesme tahtasındaki biyomalzeme levhasından bir diski çıkarmak için 18 milimetre çapında bir trephine kullanın.
Daha sonra, mikro Boyden odasının üst odasında kırmızı O halkası üzerinde disk yerleştirin. Alt hazneyi üst hazneye vidala, biyo malzemenin diskini arada sabitle. Ve bir araya getirilen mikro Boyden haznesini sterilize etmek için bir saat boyunca %70 etanolle ıslatın.
Bekletildikten sonra, etanol çıkarmak için 10 dakika boyunca steril HBSS'deki hazneyi tamamen batırın. Daha sonra 10 dakika kültür ortamı içinde oda yıkayın. Ve altı kuyuluk bir kuyunun içindeki kültür ortamına aktarArak üst haznenin yukarı doğru yöneldiğinden emin olun.
Biyomalzeme membranının alt yüzeyine temas edin, ancak üst hazneye akmayacak şekilde ortamın seviyesini ayarlayın. Pipet 100 mikrolitre hücre süspansiyonu mikro Boyden odasına membran üzerine, ve doku kültürü kuluçka dört saat kuluçka, tamamen oda batırmak için orta eklemeden önce kuluçka. Bir ila iki yaşındaki koyunların kornealarından elde edilen ekbitkilerin çoğu veya 30 yaşından küçük insan donörler bir hafta içinde ek faktör kodlu doku kültür plakalarına iliştirilir.
Altı hafta sonra, birçok küçük, sıkıca paketlenmiş hücreler ekstrplant yanında mevcuttu. Kornea endotel hücre kültürleri içinde küçük, sıkıca paketlenmiş hücreler üçlü ile sindirime dayanıklı, büyük fibroblastik hücreler ise daha duyarlıdır. Bu fark, küçük hücreleri yeni plakalara aktarmadan önce kültürlerden büyük hücreleri seçici olarak kaldırmak için yararlanıldı.
Sıkı bir kavşak proteini olan ZO-1 ve bir bağlılık kesişme proteini olan N-kadherin'i bulmak için kornea endotel hücre kültürleri üzerinde immünal uneskence analizleri yapıldı. Aynı antikorlar hem koyun hem de insan hücreleri için kullanıldı ve her iki protein de her iki türün plazma zarlarında tespit edildi. Özel yapım mikro Boyden odası, bir zarın her iki tarafının aynı anda hücre kültürü yüzeyi olarak kullanılmasına olanak sağladı.
Bir doku mühendislik hücre yapısının kesit görünümü bir yüzeyde kornea endotel hücrelerinin tek bir tabaka gösterir, ve diğer kornea stromal hücrelerinin çok katmanlı bir kültür. Bu protokolü denerken, Descemet'in zarını korneadan çıkarırken endotel'i ponplerinizle kazımaktan kaçınmanız önemlidir. Bu işlemden sonra, bir membran üzerindeki kornea endotel hücre tabakasının bütünlüğü elektrikdirenci ölçülerek kontrol edilebilir.
