Este protocolo de cultivo celular está diseñado para evitar que las células endoteliales corneales se sometan a transición epitelial a mesenquimal durante el aislamiento, la expansión y la subcultura. Los cultivos celulares se establecen a partir de explantes de tejido corneal, que se pueden reutilizar para garantizar un suministro continuo de células primarias de un donante. Comience por recubrir los pozos de una placa de cultivo de tejido de seis pozos con factor de fijación utilizando las instrucciones del fabricante.
A continuación, agregue un mililitro de medio de cultivo a cada pozo codificado. Coloque el lado del endotelio de la córnea en una placa estéril de Petri en el escenario de un microscopio diseccionante. Ajuste la iluminación de modo que la superficie corneal esté bien iluminada con suficiente contraste para resaltar la capa endotelial, y ajuste el zoom de modo que el borde y algún endotelio corneal central estén a la vista.
Utilice fórceps de relojero esterilizados para levantar y desgarrar suavemente la membrana de Descemet del estroma subyacente. Coloque la tira de membrana en uno de los pozos preparados de la placa de cultivo, asegurándose de reemplazar inmediatamente la tapa de la placa para reducir el riesgo de contaminación. Retire las tiras de la membrana de Descemet de la periferia extrema del endotelio primero, y de las regiones centrales más tarde, colocando todas las tiras de una córnea en un solo pozo.
Cuando haya terminado, incubar los explantes en una incubadora de cultivo celular humidificado de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Montar la cámara superior de la cámara micro Boyden colocando un anillo O rojo en su centro. Utilice una trete de 18 milímetros de diámetro para perforar un disco de una hoja de biomaterial en una placa de corte de PTFE.
A continuación, coloque el disco sobre el anillo O rojo en la cámara superior de la cámara micro Boyden. Atornille la cámara inferior a la cámara superior, asegurando el disco del biomaterial en el medio. Y remoje la cámara micro Boyden montada en 70% etanol durante una hora para esterilizarla.
Después del remojo, sumerja completamente la cámara en HBSS estéril durante 10 minutos para retirar el etanol. A continuación, lave la cámara en un medio de cultivo durante 10 minutos. Y transferir al medio de cultivo dentro de un pozo de una placa de seis pozos, asegurándose de que la cámara superior está orientada hacia arriba.
Ajuste el nivel del medio para que entre en contacto con la superficie inferior de la membrana de biomaterial, pero no fluya hacia la cámara superior. Pipetear 100 microlitros de suspensión celular sobre la membrana en la cámara micro Boyden, e incubarlo en la incubadora de cultivo de tejido durante cuatro horas, antes de agregar medio para sumergir completamente la cámara. La mayoría de los explantes que se derivaron de las córneas de ovejas de uno a dos años de edad o donantes humanos de menos de 30 años de edad unidos a placas de cultivo de tejido codificados por factor de unión dentro de una semana.
Después de seis semanas, muchas células pequeñas y apretadas estaban presentes junto al explant. Las células pequeñas y apretadas dentro de los cultivos celulares endoteliales corneales son resistentes a la digestión con triple, mientras que las células fibroblásticas más grandes son más sensibles a ella. Esta diferencia se aprovechó para eliminar selectivamente células grandes de los cultivos antes de transferir las células más pequeñas a nuevas placas.
Se realizaron análisis de harinaína inmunización en cultivos celulares endoteliales corneales para localizar ZO-1, una proteína de unión apretada, y N-cadherina, una proteína de unión de adherencia. Se utilizaron los mismos anticuerpos tanto para las células ovinas como para las células humanas, y ambas proteínas se detectaron en las membranas plasmáticas de las células de ambas especies. La cámara micro Boyden hecha a medida permitía que ambos lados de una membrana se utilizaran como superficies de cultivo celular simultáneamente.
Una vista transversal de una construcción de células de ingeniería de tejido muestra una sola capa de células endoteliales corneales en una superficie, y un cultivo multicapa de células estromales corneales en la otra. Al intentar este protocolo, es importante evitar raspar el endotelio con los fórceps cuando estés pelando la membrana de Descemet lejos de la córnea. Después de este procedimiento, la integridad de una capa de células endoteliales corneales en una membrana se puede comprobar midiendo su resistencia eléctrica.
