Dieses Zellkulturprotokoll wurde entwickelt, um zu verhindern, dass hornehauten Edothelzellen während der Isolation, Expansion und Subkultur epitheliale in den mesenchymalen Übergang durchlaufen. Zellkulturen werden aus Hornhautgewebe-Expflanzen hergestellt, die wiederverwendet werden können, um eine kontinuierliche Versorgung mit Primärzellen von einem Spender zu gewährleisten. Beginnen Sie mit der Beschichtung der Brunnen einer Sechs-Brunnen-Gewebekulturplatte mit Befestigungsfaktor unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers.
Fügen Sie dann jedem codierten Brunnen einen Milliliter Kulturmedium hinzu. Legen Sie die Hornhaut-Endothelseite in eine sterile Petrischale auf der Bühne eines Sezierendes Mikroskops. Stellen Sie die Beleuchtung so ein, dass die Hornhautoberfläche gut beleuchtet ist, mit genügend Kontrast, um die Endothelschicht hervorzuheben, und passen Sie den Zoom so an, dass die Kante und ein zentrales Hornhautendothel sichtbar sind.
Verwenden Sie sterilisierte Uhrmacherzange, um Descemets Membran sanft vom darunter liegenden Stroma zu heben und zu zerreißen. Legen Sie den Membranstreifen in einen der vorbereiteten Brunnen der Kulturplatte, um sofort den Deckel der Platte zu ersetzen, um das Risiko einer Kontamination zu reduzieren. Entfernen Sie die Streifen der Descemet-Membran zuerst aus der extremen Peripherie des Endothels und später aus den zentralen Regionen, indem Sie alle Streifen aus einer Hornhaut in einen einzigen Brunnen geben.
Nach Fertigstellung die Expflanzen in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid einstellen. Montieren Sie die obere Kammer der Mikro-Boyden-Kammer, indem Sie einen roten O-Ring in seine Mitte legen. Verwenden Sie ein Trephin mit einem Durchmesser von 18 Millimetern, um eine Scheibe aus einem Biomaterialblech auf einem PTFE-Schneidebrett auszustechen.
Legen Sie dann die Scheibe über den roten O-Ring in die obere Kammer der Mikro-Boyden-Kammer. Schrauben Sie die untere Kammer auf die obere Kammer und sichern Sie die Scheibe des Biomaterials dazwischen. Und die montierte Mikro-Boyden-Kammer in 70% Ethanol für eine Stunde einweichen, um sie zu sterilisieren.
Nach dem Einweichen die Kammer 10 Minuten lang vollständig in steriles HBSS eintauchen, um das Ethanol zu entfernen. Dann waschen Sie die Kammer in Kulturmedium für 10 Minuten. Und übertragen Sie auf Kulturmedium in einem Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte, um sicherzustellen, dass die obere Kammer nach oben ausgerichtet ist.
Stellen Sie den Pegel des Mediums so ein, dass es die untere Oberfläche der Biomaterialmembran kontaktiert, aber nicht in die obere Kammer fließt. Pipette 100 Mikroliter Zellsuspension auf die Membran in die Mikro Boyden Kammer, und inkubieren Sie es in der Gewebekultur Inkubator für vier Stunden, bevor Medium hinzufügen, um vollständig untertauchen die Kammer. Die meisten Expflanzen, die aus den Hornhäuten von ein- bis zweijährigen Schafen oder menschlichen Spendern von weniger als 30 Jahren gewonnen wurden, die innerhalb einer Woche an anhangsfaktorcodierten Gewebekulturplatten befestigt sind.
Nach sechs Wochen waren viele kleine, dicht gepackte Zellen neben dem Explant vorhanden. Kleine, eng gepackte Zellen innerhalb der hornförmigen Endothelzellkulturen sind resistent gegen die Verdauung mit dreifacher Vergärung, während die größeren fibroblastischen Zellen empfindlicher darauf reagieren. Dieser Unterschied wurde genutzt, um selektiv große Zellen aus den Kulturen zu entfernen, bevor die kleineren Zellen auf neue Platten übertragen wurden.
Immunale Mehleszenzanalysen wurden an hornförmigen Endothelzellkulturen durchgeführt, um ZO-1, ein enges Knotenprotein, und N-Cadherin, ein Adhärenz-Knotenprotein, zu lokalisieren. Die gleichen Antikörper wurden sowohl für Schafe als auch für menschliche Zellen verwendet, und beide Proteine wurden in den Plasmamembranen von Zellen beider Arten nachgewiesen. Die maßgeschneiderte Mikro-Boyden-Kammer ermöglichte es, beide Seiten einer Membran gleichzeitig als Zellkulturflächen zu verwenden.
Eine Querschnittsansicht eines gewebetechnischen Zellkonstrukts zeigt eine einzelne Schicht kornealer Endothelzellen auf einer Oberfläche und eine mehrschichtige Kultur von Hornhautstromalzellen auf der anderen. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, das Endothel nicht mit der Zange zu kratzen, wenn Sie Descemets Membran von der Hornhaut abziehen. Nach diesem Verfahren kann die Integrität einer hornehauten Endothelzellschicht auf einer Membran durch Messung ihres elektrischen Widerstands überprüft werden.
