Questo protocollo di coltura cellulare è progettato per evitare che le cellule endoteliali corneali subiranno una transizione epiteliale a mesenchimale durante l'isolamento, l'espansione e la sottocultura. Le colture cellulari sono stabilite da espianto di tessuti corneali, che possono essere riutilizzati per garantire un apporto continuo di cellule primarie da un donatore. Inizia rivestendo i pozzi di una piastra di coltura tissutale a sei pozzi con fattore di attacco utilizzando le istruzioni del produttore.
Quindi aggiungere un millilitro di mezzo di coltura a ogni pozzo codificato. Posizionare il lato dell'endotelio cornea in una piastra di Petri sterile sul palco di un microscopio sezionato. Regolare l'illuminazione in modo che la superficie corneale sia ben illuminata con un contrasto sufficiente per evidenziare lo strato endoteliale e regolare lo zoom in modo che il bordo e l'endotelio corneale centrale siano in vista.
Utilizzare le forcep sterilizzate dell'orologiaio per sollevare e strappare delicatamente la membrana di Descemet dallo stroma sottostante. Posizionare la striscia di membrana in uno dei pozzi preparati della piastra di coltura, assicurandosi di sostituire immediatamente il coperchio della piastra per ridurre il rischio di contaminazione. Rimuovere prima le strisce della membrana di Descemet dall'estrema periferia dell'endotelio, e dalle regioni centrali in seguito, posizionando tutte le strisce da una cornea in un unico pozzo.
Al termine, incubare le espianto in un incubatore di coltura cellulare umidificato impostato su 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Assemblare la camera superiore della camera micro Boyden posizionando un anello O rosso al centro. Utilizzare una trefina di 18 millimetri di diametro per perforare un disco da un foglio di biomateriale su un tagliere PTFE.
Quindi, posizionare il disco sopra l'anello rosso O nella camera superiore della camera micro Boyden. Avvitare la camera inferiore sulla camera superiore, fissando il disco del bio materiale nel mezzo. E immergere la camera micro Boyden assemblata al 70% di etanolo per un'ora per sterilizzarla.
Dopo l'ammollo, immergere completamente la camera in HBSS sterile per 10 minuti per rimuovere l'etanolo. Quindi lavare la camera nel mezzo di coltura per 10 minuti. E trasferimento al mezzo di coltura all'interno di un pozzo di una piastra a sei pozza, assicurandosi che la camera superiore sia orientata verso l'alto.
Regolare il livello del mezzo in modo che contatti la superficie inferiore della membrana del biomateriale, ma non flui nella camera superiore. Pipettare 100 microlitri di sospensione cellulare sulla membrana nella camera micro Boyden e incubarlo nell'incubatore di coltura tissutale per quattro ore, prima di aggiungere il mezzo per immergere completamente la camera. La maggior parte delle espianto che derivavano dalle cornee di pecore da uno a due anni o donatori umani di età inferiore ai 30 anni attaccati alle piastre di coltura dei tessuti codificate del fattore di attacco entro una settimana.
Dopo sei settimane, molte piccole cellule ben imballate erano presenti accanto all'espianto. Piccole cellule strettamente imballate all'interno delle colture cellulari endoteliali corneali sono resistenti alla digestione con tripla, mentre le cellule fibroblatiche più grandi sono più sensibili ad esso. Questa differenza è stata sfruttata per rimuovere selettivamente le cellule di grandi dimensioni dalle colture prima di trasferire le cellule più piccole in nuove piastre.
Le analisi della farescenza immunale sono state condotte su colture cellulari endoteliali corneali per localizzare ZO-1, una proteina di giunzione stretta, e N-cadherina, una proteina di giunzione di aderenza. Gli stessi anticorpi sono stati utilizzati sia per le pecore che per le cellule umane, ed entrambe le proteine sono state rilevate nelle membrane plasmatiche delle cellule di entrambe le specie. La camera micro Boyden su misura permetteva a entrambi i lati di una membrana di essere utilizzata simultaneamente come superfici di coltura cellulare.
Una vista a sezione trasversale di un costrutto cellulare di ingegneria tissutale mostra un singolo strato di cellule endoteliali corneali su una superficie, e una coltura multistrato di cellule stromali corneali dall'altra. Quando si tenta questo protocollo, è importante evitare di raschiare l'endotelio con le farse quando si sta staccando la membrana di Descemet dalla cornea. Seguendo questa procedura, l'integrità di uno strato di cellule endoteliali corneali su una membrana può essere controllata misurandone la resistenza elettrica.
