تم تصميم بروتوكول ثقافة الخلية هذا لمنع الخلايا البطانية القرنية من الخضوع للانتقال الظهاري إلى mesenchymal أثناء العزل والتوسع والثقافة الفرعية. يتم تأسيس الثقافات الخلية من explants الأنسجة القرنية، والتي يمكن إعادة استخدامها لضمان إمدادات مستمرة من الخلايا الأولية من متبرع واحد. تبدأ عن طريق طلاء الآبار من ستة بئر لوحة ثقافة الأنسجة مع عامل المرفق باستخدام تعليمات الشركة المصنعة.
ثم إضافة ملليلتر واحد من ثقافة المتوسطة لكل مرمزة جيدا. ضع بطانة القرنية في طبق بيتري معقمة على خشبة المجهر. ضبط الإضاءة بحيث يتم إضاءة سطح القرنية جيدا مع التباين كافية لتسليط الضوء على طبقة البطانية، وضبط التكبير بحيث حافة وبعض endothelium القرنية المركزية في العرض.
استخدم ملقط صانع الساعات المعقم لرفع غشاء ديسيميت وتمزقه بلطف بعيدًا عن السترما الكامن. ضع شريط الغشاء في أحد الآبار المعدة لصفيحة الاستزراع، مع التأكد من استبدال غطاء الصفيحة على الفور للحد من خطر التلوث. إزالة شرائط من غشاء Descemet من الأطراف المتطرفة من endothelium أولا، ومن المناطق الوسطى في وقت لاحق، ووضع جميع شرائط من قرنية واحدة في بئر واحد.
عند الانتهاء، احتضان explants في حاضنة ثقافة الخلية المرطبة تعيين إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تجميع الغرفة العليا من غرفة بودين الصغيرة عن طريق وضع خاتم O الأحمر في مركزها. استخدام 18 ملليمتر القطر trephine لكمة خارج قرص من ورقة المواد الحيوية على لوحة قطع PTFE.
ثم، ضع القرص فوق خاتم O الأحمر في الغرفة العليا لغرفة بودين الصغيرة. المسمار الغرفة السفلى على الغرفة العليا، وتأمين القرص المواد الحيوية في ما بين. ونقع غرفة بودين الصغيرة المجمعة في 70٪ الإيثانول لمدة ساعة واحدة لتعقيمه.
بعد نقع، تزج تماما الغرفة في HBSS العقيمة لمدة 10 دقائق لإزالة الإيثانول. ثم يغسل الغرفة في الثقافة المتوسطة لمدة 10 دقائق. ونقل إلى الثقافة المتوسطة داخل بئر من لوحة ستة جيدا، والتأكد من أن الغرفة العليا موجهة صعودا.
ضبط مستوى المتوسطة بحيث يتصل السطح السفلي للغشاء الحيوي، ولكن لا تتدفق إلى الغرفة العليا. Pipette 100 ميكرولترات من تعليق الخلية على الغشاء في غرفة بودين الصغيرة ، واحتضانها في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة أربع ساعات ، قبل إضافة المتوسطة لغمر الغرفة تمامًا. معظم explants التي كانت مستمدة من القرنيات من واحد إلى عامين من الأغنام أو المتبرعين الإنسان من أقل من 30 سنة من العمر تعلق على المرفقات عامل ترميز لوحات ثقافة الأنسجة في غضون أسبوع.
بعد ستة أسابيع، كانت العديد من الخلايا الصغيرة المعبأة بإحكام موجودة بجوار explant. الخلايا الصغيرة، معبأة بإحكام داخل ثقافات الخلايا البطانية القرنية هي مقاومة للهضم مع الثلاثي، في حين أن الخلايا الليفية أكبر أكثر حساسية لذلك. تم استغلال هذا الاختلاف لإزالة الخلايا الكبيرة بشكل انتقائي من الثقافات قبل نقل الخلايا الأصغر إلى لوحات جديدة.
أجريت تحليلات الدقيق المناعي على ثقافات الخلايا البطانية القرنية لتحديد موقع ZO-1، وهو بروتين تقاطع ضيق، وN-cadherin، وهو بروتين تقاطع الالتزام. واستخدمت نفس الأجسام المضادة لكل من الأغنام والخلايا البشرية، وتم الكشف عن كلا البروتينين في أغشية البلازما للخلايا من كلا النوعين. سمحت غرفة بودين الصغيرة المصنوعة خصيصًا باستخدام جانبي الغشاء كأسطح لثقافة الخلايا في وقت واحد.
عرض المقطع من بناء الخلايا المهندسة الأنسجة يظهر طبقة واحدة من الخلايا البطانية القرنية على سطح واحد، وثقافة متعددة الطبقات من الخلايا الهدّام القرنية على الآخر. عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم تجنب كشط البطانة مع ملقط الخاص بك عندما كنت تقشير غشاء Descemet بعيدا عن القرنية. بعد هذا الإجراء ، يمكن التحقق من سلامة طبقة الخلايا البطانية القرنية على الغشاء عن طريق قياس مقاومتها الكهربائية.
