Этот протокол клеточной культуры предназначен для предотвращения эндотелиальных клеток роговицы от прохождения эпителиального мезенхимального перехода во время изоляции, расширения и субкультуры. Клеточные культуры устанавливаются из эксплантов роговицы тканей, которые могут быть повторно использованы для обеспечения постоянного питания первичных клеток от одного донора. Начните с покрытия колодцев шести скважин ткани культуры пластины с фактором крепления с использованием инструкций производителя.
Затем добавьте один миллилитр среды культуры к каждому закодированного хорошо. Поместите сторону роговицы эндотелия в стерильную чашку Петри на сцене рассеченного микроскопа. Отрегулируйте освещение так, чтобы поверхность роговицы хорошо освещена с достаточным контрастом, чтобы выделить эндотелиальный слой, и отрегулируйте зум так, чтобы край и некоторый центральный эндотелий роговицы были в поле зрения.
Используйте стерилизованные миппы часовщика, чтобы аккуратно поднять и оторвать мембрану Descemet от лежащей в основе стромы. Поместите мембранную полосу в один из подготовленных колодцев культурной пластины, убедившись, что немедленно заменить крышку пластины, чтобы уменьшить риск заражения. Сначала удалите полоски мембраны Десемета с крайней периферии эндотелия, а затем из центральных областей, поместив все полосы из одной роговицы в один колодец.
После завершения, инкубировать explants в инкубаторе увлажненной культуры клеток установлен на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Соберите верхнюю камеру микро-камеры Boyden, поместив красное кольцо O в его центр. Используйте трефин диаметром 18 миллиметров, чтобы пробить диск из листа биоматериала на разделоной доске PTFE.
Затем поместите диск над красным кольцом O в верхней камере микро-камеры Бойдена. Винт нижней камеры на верхней камере, обеспечение диска био материала между ними. И замочите собранную микро-камеру Boyden в 70% этанола в течение одного часа, чтобы стерилизовать его.
После замачивания, полностью погрузить камеру в стерильные HBSS в течение 10 минут, чтобы удалить этанол. Затем мыть камеру в среде культуры в течение 10 минут. И перейти к культуре среды внутри хорошо из шести хорошо пластины, убедившись, что верхняя палата ориентирована вверх.
Отрегулируйте уровень среды так, чтобы она контактирует с нижней поверхностью мембраны биоматериала, но не втыкается в верхнюю камеру. Pipette 100 микролитров клеточной подвески на мембрану в микро-камера Boyden, и инкубировать его в инкубаторе культуры тканей в течение четырех часов, прежде чем добавить средний полностью погрузить камеру. Большинство эксплантов, которые были получены из роговицы от одного до двух лет овец или человеческих доноров в возрасте до 30 лет прилагается к фактору крепления закодированных пластин культуры тканей в течение недели.
После шести недель, многие небольшие, плотно упакованные клетки присутствовали рядом с explant. Маленькие, плотно упакованные клетки в культурах эндотелиальных клеток роговицы устойчивы к пищеварению с тройным, в то время как большие фибробластические клетки более чувствительны к нему. Эта разница была использована для выборочного удаления больших клеток из культур, прежде чем передавать меньшие клетки на новые пластины.
Иммунотесценция муки анализы были проведены на роговицы эндотелиальных клеточных культур, чтобы найти ЗО-1, плотный белок соединения, и N-кадерин, присоединение соединения белка. Те же антитела использовались как для овец, так и для клеток человека, и оба белка были обнаружены в плазменных мембранах клеток обоих видов. Изготовленная на заказ микро-камера Boyden позволяла одновременно использовать обе стороны мембраны в качестве поверхностей клеточной культуры.
Поперечный вид ткани инженерии клеточной конструкции показывает один слой роговицы эндотелиальных клеток на одной поверхности, и многослойной культуры роговицы стромальных клеток на другой. При попытке этого протокола, важно, чтобы избежать соскабливания эндотелия с типсами, когда вы пилинг мембраны Descemet от роговицы. После этой процедуры, целостность слоя эндотелиальных клеток роговицы на мембране может быть проверена путем измерения его электрической устойчивости.
