使用形态基因的农业细菌 -顽固玉米近亲繁殖系的介导未成熟胚胎转化

大多数玉米近亲繁殖线不能使用传统的转化协议进行基因转化。在这里，我们描述了一个快速Corn转换方法，它快速且较少依赖基因型。QuickCorn 方法利用玉米转录因子 BABY BOOM 和 WUSCHEL。

当被纳入转化载体系统时，这些基因协同作用，以刺激胚胎生长。与传统的玉米转化协议不同，QuickCorn 方法在转化过程中不涉及调用诱导步骤。我们工作中使用的二元载体的T-DNA区域包含三个关键成分，形态基因、标记基因和cre/loxP重组系统。

热诱导的 cre/loxP 重组系统包含在 T-DNA 中，以从玉米基因组中去除形态基因，使植物发育中能正常再生。大约两到三天后，丝绸已经出现，如果花粉将在第二天可用，切丝绸和外壳70%乙醇消毒剪刀，约2 1/2厘米以下的壳叶，丝绸出现的地方，并覆盖丝绸与拍摄袋。一旦从流苏中出来，用流苏袋盖住流苏，并在茎周围的袋子底部放置一个非滑滑的回形针。

放置流苏袋后的第二天早上，轻轻弯曲植物，并轻点袋子，鼓励花粉释放。然后取出流苏袋，将袋子的顶部折叠起来，防止花粉逸出。给受助植物授粉，将丝丝暴露，并迅速将流苏袋的花粉倒入丝绸上。

立即用流苏袋盖住授粉的耳朵，用订书针固定袋的底座。要检查未成熟的胚胎大小，授粉后9至12天，轻轻拉下外壳，在耳朵周长的1/3至1/4之间和耳朵周围约1/3的距离下露出内核。使用手术刀切掉单个内核的盖子，该帽在大小和颜色上与大多数其他内核相似，并使用带尺子的铲子提取胚胎。

然后使用尺子或卡钳测量胚胎的长度。在收获的一到四天内，从收获的耳朵上取下的花纹和丝，并将适当的手柄插入每个耳朵的顶部或底座。将耳朵淹没在无菌层流罩中的消毒漂白剂溶液大容器中，手柄朝上。

20分钟后，用大量新鲜无菌蒸馏水冲洗耳朵三次，每次洗涤5分钟，然后让耳朵干燥几分钟。接下来，用700A液体介质填充每只耳朵一个两毫升的微离心管，并使用无菌手术刀去除每个内核冠的顶部一到两毫米，以暴露耳朵的内侧。在面对耳尖的一侧，靠近附着在角的一侧，找到内核内的未成熟胚胎。

对于顶级处理者和右手操作者，将耳朵放在一个大无菌培养皿上，并在离胚胎最远的内侧膜中插入一个微铲。轻轻向上扭动以分离内侧，露出胚胎，并使用铲子小心地将胚胎放入一管 700A 液体介质中。对于用左手握住耳朵的基地处理者，将一根微铲插入离胚胎最远的内侧膜，然后轻轻向上扭动以将内分膜分离。

在农业细菌悬浮培养中培养胚胎，将新鲜准备好的工作板中培养出10毫升的700A液体介质，并旋转以完全悬浮细菌培养。测量波长为550纳米的光学密度，用一毫升新鲜700A介质清洗胚胎。将胚胎浸入一毫升的农业细菌悬浮液中，并在低设置下旋转30秒。

将胚胎在长凳上以水平方向沉淀五分钟，然后将每个管子的全部内容转移到562V共培养介质的单个板上。轻轻旋转板，均匀分布胚胎，吸出过量的农业细菌悬浮液。小心地定位胚胎，圆顶形状的侧面朝上，注意避免损坏胚胎。

然后将盘子放入塑料盒中，在黑暗中21摄氏度下过夜孵育。第二天早上，小心地将受感染的胚胎移植到605T的休息介质上，每盘放置约30个胚胎，侧向上，在黑暗中26摄氏度下进行4至10天的孵育。大约七天后，体细胞胚胎发育可以在受精卵体表面观察到。

在休息时间结束时，将胚盒放在45摄氏度的孵化器中，相对湿度为70%，两小时，然后在黑暗中26摄氏度下孵育1至2小时。在孵育结束时，将10至15个热震不成熟的胚胎放在单独盘的射丸形成介质上，并辅以每升05毫克的除草剂 imazapyr 作为选择性剂。根据需要小心地取出任何细胞，将胚胎返回到26摄氏度的黑暗孵化器两周。

在孵育结束时，将每盘约8块组织转移到根化中板上，在27摄氏度下进行一至两周的孵育，16小时光，8小时黑暗。随着植物的发展，将一种含有芽和生根的更强壮的植物在光的根培养的单个板块上放置7至14天。允许未完全发育的芽在同一介质上再孵育一到两周，直到它们准备好被移动到土壤中。

当植物变得更有活力时，用自来水冲洗根部以去除加糖。然后将单个植物移植到三英寸的盆中，在带排水孔的托盘中装有预湿的无土基材，然后将托盘放在带或没有塑料湿度圆顶的生长室中。锅移植后9至14天，将每只带土壤的植物移植到1.5加仑的锅中。

在锅中加入一个受控释放肥料，并维持温室中的植物。当耳芽开始从植物中浮现时，使用半透明芽袋盖住射芽，这样在不取下袋子的情况下即可观察出正在出现的丝绸。然后如所证明的，在适当的发育阶段对植物授粉。

玉米耳朵一般在授粉后9至12天收获。长度在1.5至2毫米之间的不成熟胚胎是本协议转化的最佳外植体。感染后八天，ZsGreen表达体细胞胚胎可以通过荧光显微镜进行可视化。

热处理8天后感染诱导克火重组酶表达，导致切除的形态基因，cre和ZsGreen表达盒在两个loxP位点之间侧翼。经过三到四周的培养，在含有除草剂的芽形成介质，增殖组织与成熟的胚胎或芽芽对除草剂耐药可以观察到。一些抗除草剂组织可能对 ZsGreen 呈阴性，这表明这些组织中可能发生由克里调解的切除。

将组织移动到中生肖孵育后，可以收获健康、有活力、生长良好的芽。请注意，某些组织可能由于克隆植物具有相同的转基因整合模式而出现多个芽。QuickCorn方法可以大大提高玉米转化效率，扩大可转化基因型的清单。

通过最少的玉米转化培训，研究人员可以成功地复制该协议。使用 QuickCorn 方法，根植植物应在感染后五到七周内准备好转移到土壤中。注意介质组成、亚文化的时间安排以及温度和照明条件。

起始材料的质量对于成功改造也至关重要。本协议中使用的化学品、漂白剂溶液和除草剂是生物危害。请确保在使用过程中佩戴适当的个人防护设备。