Hello.Today 我们将向您展示一种方案，该方案可以原生质体数百万玉米叶肉细胞，并高效转化它们。该方案的主要步骤是首先消化和去除植物细胞壁，释放原生质体，然后使用PEG转化原生质体。该协议与其他协议之间的最大区别在于转换的规模。
大多数方案最终得到1， 000到10， 000个转化的原生质体。然而，我们的协议提供了数百万个转化的玉米原生质体。在这里，我们有玉米幼苗在发芽后在黑暗中生长 9 到 11 天。
将幼苗切到土壤水平以上，放入水中。不使用时将植物放在黑暗中。选择每个幼苗的第二和第三叶，注意排除棕色或受损区域的叶子。
选择 12 到 16 片叶子，从尖端切下一厘米。然后从每片叶子上切下 10 厘米的部分。将叶子部分堆叠在一起，基端在一起。
使用活页夹夹在基端将束夹在一起。将叶子束放在一张白纸上。切开0.5至1毫米宽的叶片。
切成一致的薄片很重要。切下部分叶束后，将切片转移到酶溶液中。不要让材料变干。
轻轻旋转酶溶液以润湿材料。将箔纸放在烧杯上以阻挡光线。重复此过程，直到整个束在靠近活页夹的地方被切割。
切割后，解决方案应如下所示。将酶溶液的烧杯转移到钟形罐中。在室温下真空渗透三分钟。
在室温下以40RPM在桌面摇床上孵育两个半小时。孵育后，给溶液一个漩涡。它应该看起来是乳白色的，表明消化成功。
在室温下以 80 RPM 在桌面摇床上再孵育 10 分钟。将装有酶溶液的烧杯放在冰上。通过添加一体积冰冷的MMG来停止消化。
通过40微米的细胞过滤器过滤到50毫升的离心管中。将溶液分成每份不超过10毫升的等分试样。倒入冷却的圆底玻璃管中。
将试管以 100 G 离心四分钟。取出上清液，确保不要干扰沉淀。重悬，然后合并样品以进行后续洗涤。
用五毫升MMG洗涤原生质体两次。每次以 100 G 的速度向下旋转三分钟。颗粒应该是美丽的亮黄绿色。
您可以通过轻轻旋转试管来重新悬浮颗粒。重悬于一毫升MMG中，并稀释少量等分试样10至20倍以进行计数。在等分之前重新悬浮很重要，因为原生质体会很快沉降。
将稀释的原生质体装入血细胞计数器中。在光学显微镜下计数原生质体。一个好的准备工作在洗涤后不会有太多多余的碎屑漂浮。
良好的原生质体是圆形的，带有可见的质体。使用单元格计数计算总数。这种制备结果刚刚超过1000万个原生质体。
我们建议使用荧光素二乙酸酯染料检查活性。成功的原生质体分离产生70%至90%的活力将原生质体与感兴趣的质粒混合。这个例子使用了100万个原生质体和15微克的DNA。
在冰上孵育30分钟。通过敲击管子的侧面重新悬浮。加入PEG溶液以达到12%PEG的终浓度。
倒置几次轻轻混合。原生质体和PEG溶液很脆弱，所以不要摇晃试管。在室温下在黑暗中孵育10分钟。
用五体积的孵育溶液稀释，并通过倒置轻轻混合。将试管以 100 G 离心四分钟。用一毫升孵育缓冲液洗涤一次。
小心不要打扰颗粒。以 100 G 离心三分钟。重悬于孵育缓冲液中至浓度为每微升500至1000个细胞。
在室温下在黑暗中孵育过夜。第二天，以 100 G 的速度旋转四分钟。用冷藏培养液洗涤两次。
在室温下以 100 G 每次旋转三分钟。重新悬浮，然后将少量等分试样加载到血细胞计数器上进行最终检查。首先，计算明场下的原生质体总数。
现在，观察在紫外线下发出荧光的原生质体部分以验证转染。原生质体正在表达我们的GFP记者。现在，让我们得到一些关于转染效率的指标。
在这次制备中，我们获得了1000万个原生质体，其中我们转染了100万个。第二天，我们恢复了335，000。其中，我们的转化率为30.3%，这使我们总共有大约100， 000个表达GFP的原生质体。
转染效率可能会有所不同。正如您在图表中看到的，我们经常看到重复准备的效率在 20% 到 50% 之间。该协议允许收集和转化数百万个玉米叶肉原生质体。
该协议最好的部分之一是其扩展能力。通过缩放体积以及转化中使用的原生质体数量，您可以将转化量提高到我们今天显示的数量级以上。迄今为止，我们最大的单管实验从 2000 万个原生质体和 200 微克 DNA 开始，到第二天以 310 万个转化原生质体结束。
当您需要测试许多不同的质粒构建体时，这种高通量方案特别有用，但合作者已将此协议用于不需要扩大规模能力的目的，例如设计合成基因回路和玉米。感谢您观看我们的视频。我们希望它有所帮助。
