Большинство инбредных линий кукурузы не могут быть генетически преобразованы с помощью обычных протоколов трансформации. Здесь мы описываем метод преобразования быстрого и менее зависимого от генотипа. Метод «Быстрый кукуруза» использует факторы транскрипции кукурузы BABY BOOM и WUSCHEL.
При включении в векторную систему трансформации эти гены работают синергетически, стимулируя эмбриональный рост. В отличие от обычных протоколов преобразования кукурузы, метод быстрого кукурузы не включает в себя этап индукции каллуса во время преобразования. Область Т-ДНК двоичного вектора, используемая в нашей работе, содержит три ключевых компонента: морфогенные гены, маркерные гены и рекомбинацию cre/loxP.
Система рекомбинации крем/локсП была включена в Т-ДНК для удаления морфогенных генов из генома кукурузы, чтобы обеспечить нормальную регенерацию каллуса в развитии растений. Примерно через два-три дня после шелка появились, и если пыльца будет доступна на следующий день, сократить шелка и шелухи с 70% этанола стерилизованных ножниц, примерно 2 1 / 2 сантиметра ниже конца листьев шелухи, где шелк возникают, и покрыть шелк с стрелять мешок. После того, как пыльников выйти из кисти, покрыть кисти с кисточка мешок, и место без заноса бумажной зажима в основании мешок вокруг стебля.
На следующее утро после размещения кищной мешок, осторожно согнуть растение, и нажмите мешок, чтобы поощрять пыльцу, чтобы быть освобождены. Затем снимите кисточка мешок, и сложить верхнюю часть мешка, чтобы предотвратить пыльцу от побега. Чтобы опылить растение-реципиент, разоблачить шелк, и быстро залить пыльцу из кистой мешок на шелк.
Немедленно накройте опыляемое ухо кистей мешок, и обеспечить основание мешок вокруг стебля скобы. Чтобы проверить размер незрелого эмбриона, от девяти до 12 дней после опыления, осторожно стяните шелуху, чтобы разоблачить ядра примерно на 1/3 до 1/4 окружности уха и около 1/3 расстояния вниз по уху. Используйте скальпель, чтобы отрезать крышку одного ядра, которое кажется похожим на большинство других ядер по размеру и цвету, и использовать шпатель с линейкой для извлечения эмбриона.
Затем используйте линейку или калипер для измерения длины эмбриона. В течение одного-четырех дней после сбора урожая, удалить шелуху и шелк из собранных ушей, и вставить соответствующую ручку в верхней или основания каждого уха. Погрузите уши в большой контейнер для дезинфекции раствора отбеливателя в стерильный ламинарный капюшон потока с ручкой вверх.
Через 20 минут, промыть уши три раза с щедрым объемом свежей стерильной дистиллированной воды в течение пяти минут за стирку, прежде чем позволить уши высохнуть в течение нескольких минут. Затем заполните одну двухмиллилитровую микроцентрифугную трубку на ухо жидкой средой 700A и используйте стерильный скальпель, чтобы удалить верхнюю от одного до двух миллиметров каждой коронки ядра, чтобы разоблачить эндосперм уха. Найдите незрелый эмбрион в ядре сбоку, обращенную к кончику уха, рядом с креплением к початку.
Для верхней обработчик и правша операторов, отдых ухо на большой стерильной чашки Петри, и вставить микро шпатель в эндосперм в перикарпе дальше от эмбриона. Аккуратно закрутите вверх, чтобы выбить эндосперм и разоблачить эмбрион, и используйте шпатель, чтобы тщательно поместить эмбрион в одну трубку жидкой среды 700A. Для операторов базового обработчика, держащих ухо левой рукой, вставьте микро шпатель в эндосперм в перикарпе дальше от эмбриона, и аккуратно крутите вверх, чтобы выбить эндосперм.
Для культуры эмбрионов в культуре подвески Agrobacterium, собирать бактерии из свежеприготовленной рабочей пластины в 10 миллилитров 700A жидкой среды, и вихрь, чтобы приостановить культуру бактерий полностью. Измерьте оптическую плотность на длине волны 550 нанометров и помойте эмбрионы одним миллилитром свежей среды 700A. Погрузите эмбрионы в один миллилитр подвески Agrobacterium и вихрь на низкой установке в течение 30 секунд.
Поселить эмбрионы на скамейке с трубками в горизонтальной ориентации в течение пяти минут, прежде чем передать все содержимое каждой трубки на отдельные пластины 562V совместного культивирования среды. Аккуратно закружить пластины, чтобы равномерно распределить эмбрионы, и аспирировать избыток подвески Agrobacterium. Тщательно сориентировать эмбрионы с куполообразной стороны лицом вверх, заботясь, чтобы избежать повреждения эмбрионов.
Затем поместите пластины в пластиковые коробки для ночной инкубации при 21 градусов по Цельсию в темноте. На следующее утро, тщательно перенести инфицированных эмбрионов на отдых средней 605T, место около 30 эмбрионов на тарелку, scutellum стороне вверх, для четырех-10-дневной инкубации при 26 градусов по Цельсию в темноте. Примерно в семь дней на поверхности зигоготического скутеллума наблюдается развитие соматических эмбрионов.
В конце периода отдыха поместите коробку эмбрионов в инкубатор 45 градусов по Цельсию с 70%-ной относительной влажностью в течение двух часов, а затем один-два часа инкубации при 26 градусов по Цельсию в темноте. В конце инкубации поместите от 10 до 15 тепловых незрелых эмбрионов на отдельные пластины среды образования стрелять дополнены 05 миллиграммов на литр гербицида imazapyr в качестве селективного агента. Тщательно удалите все колеоптила по мере необходимости, и вернуть эмбрионы в 26-градусный Тюмный инкубатор по Цельсию в течение двух недель.
В конце инкубации перенесите около восьми кусков ткани на тарелку на укореняющие средние пластины для инкубации от одной до двух недель с 16 часами света и восемью часами темноты при 27 градусах Цельсия. По мере развития растений, поместите один сильный плантатор, содержащий как побеги и энергичные корни на отдельные пластины укоренения среды под светом в течение еще семи до 14 дней. Разрешить побеги, которые не полностью разработаны, чтобы быть инкубированы на той же среде в течение еще одной-двух недель, пока они не будут готовы быть перемещены в почву.
Как растение становится более энергичным, промыть корни с водопроводной водой, чтобы удалить агар. Затем пересадите отдельные растения в трехдюймовые горшки, содержащие предварительно смоченный безземеленный субстрат в лоток с дренажными отверстиями, и поместите лоток в камеру роста с пластиковым куполом влажности или без него. Через 9-14 дней после переноса горшка пересадим каждый плантатор с почвой в 1,5-галлонный горшок.
Добавьте контролируемое удобрение в кастрюлю и поддерживайте растения в теплице. Когда ухо побеги начинают выходить из растения, использовать полупрозрачный мешок стрелять, чтобы покрыть побеги так, что возникающие шелка можно наблюдать, не снимая мешок. Затем опыляют растения на соответствующем этапе развития, как попродемонстрировано.
Уши кукурузы обычно собирают через 9-12 дней после опыления. Незрелые эмбрионы длиной от 1,5 до двух миллиметров являются лучшими эксплантами для преобразования для этого протокола. Через восемь дней после инфицирования соматические эмбрионы, выражающих сурин, можно визуализировать с помощью микроскопии флуоресценции.
Тепловая обработка через восемь дней после того, как инфекция вызывает экспрессию cre recombinase, в результате чего иссечение морфогенного гена, cre, и кассеты экспрессии sGreen в окружении между двумя участками loxP. После трех-четырех недель культуры на стрелять формирования среды, содержащей гербицид, размножающиеся ткани с созревания эмбрионов или стрелять почки устойчивы к гербициду можно наблюдать. Некоторые из устойчивых к гербицидам тканей могут быть отрицательными для ЗГрин, предполагая, что cre-опосредованное иссечение, вероятно, произошло в этих тканях.
После перемещения тканей к укоренению среднего и легкого инкубации можно собрать здоровые, энергичные, растущие побеги с хорошо развитыми корнями. Обратите внимание, что некоторые ткани могут показаться, что несколько побегов, возможно, из-за клональных растений, имеющих идентичные трансгенные модели интеграции. Метод «Быстрый желудь» может значительно повысить эффективность преобразования кукурузы и расширить список трансформируемых генотипов.
Протокол может быть успешно воспроизведен исследователями с минимальным обучением преобразования кукурузы. Используя метод быстрого кукурузы, корнеи растений должны быть готовы к передаче в почву всего через пять-семь недель после дня инфекции. Обратите внимание на средний состав, сроки субкультур, температуру и условия освещения.
Качество стартовых материалов также имеет важное значение для успешной трансформации. Химические вещества, раствор отбеливателя и гербициды, используемые в этом протоколе, являются биологически случайными. Пожалуйста, убедитесь, что носить соответствующее оборудование личной защиты во время их использования.
