Çoğu mısır inbred hatları genetik geleneksel dönüşüm protokolleri kullanılarak dönüştürülemez. Burada, hızlı ve daha az genotip bağımlı bir QuickCorn dönüşüm yöntemi açıklar. QuickCorn yöntemi mısır transkripsiyon faktörleri BABY BOOM ve WUSCHEL kullanır.
Dönüşüm vektör sistemine dahil edildiğinde, bu genler sinerjik olarak embriyojenik büyümeyi teşvik etmek için çalışırlar. Geleneksel mısır dönüşüm protokollerinin aksine, QuickCorn yöntemi dönüşüm sırasında bir nasır indüksiyon adımı içermez. Çalışmamızda kullanılan ikili vektörün T-DNA bölgesi üç temel bileşen, morfojenik genler, marker genleri ve cre/loxP rekombinasyon sistemini içerir.
Isıya bağlı kre/loxP rekombinasyon sistemi, bitki gelişiminde normal nasır rejenerasyonuna izin vermek için mısır genomundaki morfojenik genleri çıkarmak için T-DNA'ya dahil edildi. İpeklerin ortaya çıkmasından yaklaşık 2-3 gün sonra polen ler ertesi gün mevcut olacaksa, ipekleri ve kabuğu %70 etanol sterilize edilmiş makasla, ipeklerin ortaya çıktığı kabuğun ucunun yaklaşık 2,5 santimetre altında, kesilen ve bir ateş torbasıyla kaplayın. Bir kez anthers bir püskül ortaya, püskül bir püskül torba ile kapağı ve sap etrafında çantanın tabanına kaymaz bir ataş yerleştirin.
Püskül lülesini yerleştirdikten sonra sabah, bitkiyi hafifçe bükün ve polenlerin serbest bırakılmasını teşvik etmek için torbaya dokunun. Sonra püskül lüzmunu çıkarın ve polenlerin kaçmasını önlemek için torbanın üst kısmını katlayın. Alıcı bir bitkiyi tozlaşmak için, ipek ortaya çıkarmak ve hızlı bir şekilde ipek üzerine püskül torbasından polen dökün.
Hemen püskül lüzmuyla tozlanmış kulağı kapatın ve sapın etrafındaki çantanın tabanını zımbalarla sabitlayın. Olgunlaşmamış embriyo boyutunu kontrol etmek için, tozlaşmadan 9 ila 12 gün sonra, yavaşça kulak çevresi nin yaklaşık 1/3 ila 1/4 çekirdekleri ortaya çıkarmak için kabuğu aşağı çekin ve kulak aşağı mesafe yaklaşık 1/3. Boyut ve renk diğer çekirdeklerin çoğunluğu benzer görünen tek bir çekirdeğin kapağını kesmek için bir neşter kullanın ve embriyo ayıklamak için bir cetvel ile bir spatula kullanın.
Sonra embriyo uzunluğunu ölçmek için cetvel veya kaliper kullanın. Hasattan sonraki bir ila dört gün içinde, hasat edilen kulaklardan kabukları ve ipekleri çıkarın ve her kulağın üst veya tabanına uygun bir sap takın. Kulakları, kolu yukarı bakacak şekilde steril laminar akış kaputunda büyük bir dezenfeksiyon çamaşır suyu çözeltisi kabına batırın.
20 dakika sonra, kulakların birkaç dakika kurumasını vermeden önce yıkama başına beş dakika boyunca cömert bir tatlı steril distile su hacmi ile kulakları üç kez durulayın. Daha sonra, 700A sıvı orta ile kulak başına bir iki mililitrelik mikrosantrifüj tüp doldurun ve kulak endosperm ortaya çıkarmak için her çekirdek taç üst bir ila iki milimetre kaldırmak için steril bir neşter kullanın. Kabın eki yakınında, kulağın ucuna bakan tarafta çekirdek içinde olgunlaşmamış embriyo bulun.
Üst düzey işleyici ve sağ elli operatörler için, kulağı büyük steril petri kabına koyun ve embriyodan en uzak pericarp'taki endosperme mikro spatula yerleştirin. Yavaşça endosperm yerinden ve embriyo ortaya çıkarmak için yukarı doğru büküm ve dikkatle 700A sıvı orta bir tüp içine embriyo yerleştirmek için spatula kullanın. Sol el ile kulağı tutan baz işleyici operatörleri için, embriyodan en uzak pericarp'taki endosperme mikro bir spatula yerleştirin ve endospermi çıkarmak için yavaşça yukarı doğru bükün.
Bir Agrobacterium süspansiyon kültüründe embriyolar kültür için, 700A sıvı orta 10 mililitre içine yeni hazırlanmış çalışma plakası bakteri toplamak ve girdap tamamen bakteri kültürünü askıya almak için. Optik yoğunluğu 550 nanometre dalga boyunda ölçün ve embriyoları bir mililitre taze 700A orta ile yıkayın. Embriyoları bir mililitre Agrobacterium süspansiyonuna batırın ve 30 saniye boyunca düşük bir ayarda girdap.
562V ortak yetiştirme aracının ayrı ayrı plakaları üzerine her tüpün tüm içeriğini aktarmadan önce beş dakika boyunca yatay bir yönde tüpler ile bankta embriyolar yerleştirin. Yavaşça eşit embriyolar dağıtmak için plakaları girdap, ve aşırı Agrobacterium süspansiyon aspire. Dikkatle kubbe şeklinde tarafı yukarı bakacak şekilde embriyolar yönlendirmek, embriyolar zarar önlemek için özen.
Sonra karanlıkta 21 santigrat derece bir gecede kuluçka için plastik kutular içine plakalar yerleştirin. Ertesi sabah, dikkatlice dinlenme orta 605T üzerine enfekte embriyolar transfer, plaka başına yaklaşık 30 embriyo yerleştirin, scutellum yan kadar, karanlıkta 26 santigrat derece de dört ila 10 günlük kuluçka için. Yaklaşık yedi gün içinde, somatik embriyo gelişimi zigotik scutellum yüzeyinde görülebilir.
Dinlenme süresinin sonunda, embriyo kutusunu 45 derecelik bir inkübatöre yerleştirin ve ardından karanlıkta 26 santigrat derecede bir ila iki saatlik kuluçka yada bir ila iki saatlik bir kuluçka oranı na sahip olun. Kuluçka sonunda, seçici bir ajan olarak herbisit imazapyr litre başına 05 miligram ile takviye ateş oluşumu orta bireysel plakalar üzerine 10 ila 15 ısı şoklu olgunlaşmamış embriyolar yerleştirin. Gerektiği gibi coleoptileleri dikkatlice çıkarın ve embriyoları iki hafta boyunca 26 derecelik koyu kuvöze geri götürün.
Kuluçka sonunda, 16 saat ışık ve 27 santigrat derecede sekiz saat karanlık ile bir-iki haftalık kuluçka için orta plakalar köklendirme üzerine plaka başına doku yaklaşık sekiz adet aktarın. Plantetler geliştikçe, yedi ila 14 gün boyunca ışık altında orta kökleme bireysel plakalar üzerine hem sürgünler ve güçlü kökleri içeren güçlü bir plantlet yerleştirin. Toprağa taşınmaya hazır olana kadar bir ila iki hafta boyunca aynı ortamda kuluçkaya yatabilecek şekilde tam olarak gelişmemiş sürgünlere izin verin.
Bitki daha güçlü hale geldikçe, agar kaldırmak için musluk suyu ile kökleri durulayın. Daha sonra drenaj delikleri olan bir tepsi içinde önceden ıslak topraksız bir substrat içeren üç inç tencere içine bireysel bitkiler nakli ve plastik bir nem kubbe ile veya olmadan bir büyüme odasına tepsi yerleştirin. Pot transferinden 9 ila 14 gün sonra, her bitkiyi toprakla birlikte 1,5 galonluk bir tencereye nakledin.
Pota kontrollü bir gübre ekleyin ve seradaki bitkileri koruyun. Kulak sürgünleri bitkiden çıkmaya başladığında, ortaya çıkan ipeklerin torbayı çıkarmadan gözlemlenebilmeleri için sürgünleri kapsayacak şekilde yarı saydam bir sürgün torbası kullanın. Daha sonra bitkilerin gelişimin uygun aşamasında tozlaşmak gösterildiği gibi.
Mısır kulakları genellikle tozlaşmadan 9 ila 12 gün sonra hasat edilir. Uzunlukları 1,5 ile iki milimetre arasında değişen olgunlaşmamış embriyolar bu protokol için dönüşüm için en iyi eksperlerdir. Enfeksiyondan sekiz gün sonra, ZsGreen ifade somatik embriyolar floresan mikroskopi ile görselleştirilmiş olabilir.
Isıl işlem sekiz gün sonra enfeksiyon cre rekombinaz ekspresyonu indükler, morfojenik gen eksizyonu ile sonuçlanan, cre, ve ZsGreen ifade kasetleri iki loxP siteleri arasında çevrili. Herbisit içeren çekim formasyon uzerine 3-4 hafta süren kültürden sonra, olgunlaşan embriyolar ile çoğalan dokular veya herbisite dirençli ateş tomurcukları görülebilir. Herbisit dirençli dokuların bazıları ZsGreen için negatif olabilir, cre aracılı eksizyon muhtemelen bu dokularda meydana geldiğini düşündürmektedir.
Dokuların köklenme ortamına ve hafif kuluçkaya taşınmasından sonra, sağlıklı, dinç, iyi gelişmiş köklere sahip büyüyen sürgünler hasat edilebilir. Bazı dokuların muhtemelen aynı transgen entegrasyon desenlerine sahip klonal bitkiler nedeniyle birden fazla sürgünleri var gibi görünebilir unutmayın. QuickCorn yöntemi büyük ölçüde mısır dönüşüm verimliliğini artırmak ve dönüştürülebilir genotipler listesini genişletmek.
Protokol, minimum mısır dönüşüm eğitimi ne olursa olsun araştırmacılar tarafından başarıyla çoğaltılabilir. QuickCorn yöntemini kullanarak, köklü bitkiler enfeksiyon gününden sonra sadece beş ila yedi hafta içinde toprağa aktarmak için hazır olmalıdır. Orta kompozisyona, alt kültürlerin zamanlamasına, sıcaklık ve aydınlatma koşullarına dikkat edin.
Başarılı dönüşüm için başlangıç malzemelerinin kalitesi de gereklidir. Bu protokolde kullanılan kimyasallar, çamaşır suyu çözeltisi ve herbisit biyolojik olarak tehlikelidir. Lütfen kullanımları sırasında uygun kişisel koruma ekipmanLarını kullandığınızdan emin olun.
