La mayoría de las líneas endogázcas de maíz no pueden transformarse genéticamente utilizando protocolos de transformación convencionales. Aquí, describimos un método de transformación QuickCorn que es rápido y menos dependiente del genotipo. El método QuickCorn utiliza factores de transcripción de maíz BABY BOOM y WUSCHEL.
Cuando se incorporan en el sistema vectorial de transformación, estos genes trabajan sinérgicamente para estimular el crecimiento embrionario. A diferencia de los protocolos convencionales de transformación del maíz, el método QuickCorn no implica un paso de inducción del callo durante la transformación. La región de ADN-T del vector binario utilizado en nuestro trabajo contiene tres componentes clave, genes morfogénicos, genes marcadores y el sistema de recombinación cre/loxP.
El sistema de recombinación cre/loxP inducido por el calor se incluyó en el ADN-T para eliminar los genes morfogénicos del genoma del maíz para permitir la regeneración normal del callo en el desarrollo de las plantas. Aproximadamente dos o tres días después de que las sedas hayan surgido y si el polen estará disponible al día siguiente, cortar las sedas y la cáscara con 70%tijeras esterilizadas con etanol, aproximadamente 2 1/2 centímetros por debajo del extremo de las hojas de cáscara, donde emergen las sedas, y cubrir la seda con una bolsa de tiro. Una vez que las anteras emergen de una borla, cubra la borla con una bolsa de borlas y coloque un clip de papel antideslizante en la base de la bolsa alrededor del tallo.
La mañana después de colocar la bolsa de borlas, doble suavemente la planta y toque la bolsa para fomentar la liberación del polen. A continuación, retire la bolsa de borlas y doble la parte superior de la bolsa para evitar que el polen escape. Para polinizar una planta receptora, exponga las sedas y vierta rápidamente el polen de la bolsa de borlas sobre las sedas.
Cubra inmediatamente la oreja polinizada con la bolsa de borlas y fije la base de la bolsa alrededor del tallo con grapas. Para comprobar el tamaño del embrión inmaduro, de nueve a 12 días después de la polinización, tire suavemente hacia abajo de la cáscara para exponer los granos a aproximadamente 1/3 a 1/4 de la circunferencia del oído y aproximadamente 1/3 de la distancia por la oreja. Utilice un bisturí para cortar la tapa de un solo núcleo que parezca similar a la mayoría de otros núcleos en tamaño y color, y utilice una espátula con una regla para extraer el embrión.
A continuación, utilice la regla o una pinza para medir la longitud del embrión. Dentro de uno a cuatro días de cosecha, retire las cáscaras y sedas de las orejas cosechadas, e inserte un mango apropiado en la parte superior o en la base de cada oreja. Sumerja las orejas en un recipiente grande de solución de lejía de desinfección en una capucha de flujo laminar estéril con el mango hacia arriba.
Después de 20 minutos, enjuague las orejas tres veces con un volumen generoso de agua destilada estéril fresca durante cinco minutos por lavado antes de dejar que las orejas se sequen durante varios minutos. A continuación, llene un tubo de microcentrífuga de dos mililitros por oído con un medio líquido 700A, y utilice un bisturí estéril para quitar la parte superior de uno a dos milímetros de cada corona del núcleo para exponer el endospermo de la oreja. Localice el embrión inmaduro dentro del núcleo en el lado frente a la punta de la oreja, cerca de la unión a la mazorca.
Para los operadores de manipulador superior y diestro, descanse la oreja sobre un plato de Petri estéril grande e inserte una micro espátula en el endospermo en el pericarpo más alejado del embrión. Gire suavemente hacia arriba para desalojar el endospermo y exponer el embrión, y utilice la espátula para colocar cuidadosamente el embrión en un tubo de 700A medio líquido. Para los operadores de manipuladores de base que sostienen la oreja con la mano izquierda, inserte una micro espátula en el endospermo en el pericarpo más alejado del embrión, y gire suavemente hacia arriba para desalojar el endospermo.
Para cultivar los embriones en un cultivo de suspensión de Agrobacterium, recoger bacterias de una placa de trabajo recién preparada en 10 mililitros de medio líquido 700A, y vórtice para suspender el cultivo de bacterias por completo. Mida la densidad óptica a una longitud de onda de 550 nanómetros y lave los embriones con un mililitro de medio fresco de 700A. Sumerja los embriones en un mililitro de suspensión de Agrobacterium, y el vórtice en un ajuste bajo durante 30 segundos.
Asentar los embriones en el banco con los tubos en orientación horizontal durante cinco minutos antes de transferir todo el contenido de cada tubo a placas individuales de medio de cultivo de 562V. Arremolina suavemente las placas para distribuir los embriones uniformemente, y aspirar el exceso de suspensión de Agrobacterium. Orienta cuidadosamente los embriones con el lado en forma de cúpula hacia arriba, teniendo cuidado de evitar dañar los embriones.
A continuación, coloque las placas en cajas de plástico para una incubación durante la noche a 21 grados centígrados en la oscuridad. A la mañana siguiente, transfiera cuidadosamente los embriones infectados al medio en reposo 605T, coloque unos 30 embriones por placa, del lado del escutellum hacia arriba, para una incubación de cuatro a 10 días a 26 grados centígrados en la oscuridad. Alrededor de siete días, se puede observar el desarrollo de embriones somáticos en la superficie del escutellum cigolítico.
Al final del período de descanso, coloque la caja de embriones en una incubadora de 45 grados Celsius con 70% de humedad relativa durante dos horas, seguida de una incubación de una a dos horas a 26 grados centígrados en la oscuridad. Al final de la incubación, coloque de 10 a 15 embriones inmaduros con choque térmico en placas individuales de medio de formación de brotes complementados con 05 miligramos por litro del imazapyr herbicida como agente selectivo. Retire cuidadosamente los coleóptiles según sea necesario y devuelva los embriones a la incubadora oscura Celsius de 26 grados durante dos semanas.
Al final de la incubación, transfiera alrededor de ocho trozos de tejido por placa a placas medianas de enraizamiento para una incubación de una a dos semanas con 16 horas de luz y ocho horas de oscuridad a 27 grados centígrados. A medida que las plantaciones se desarrollan, coloque una planta más fuerte que contenga tanto brotes como raíces vigorosas en placas individuales de medio de enraizamiento bajo la luz durante otros siete a 14 días. Permita que los brotes que no están completamente desarrollados se incuban en el mismo medio durante otra a dos semanas hasta que estén listos para ser trasladados al suelo.
A medida que la planta se vuelve más vigorosa, enjuague las raíces con agua del grifo para eliminar el agar. A continuación, trasplantar las plantas individuales en macetas de tres pulgadas que contengan un sustrato sin suelo prehumedezca en una bandeja con orificios de drenaje, y coloque la bandeja en una cámara de crecimiento con o sin una cúpula de humedad de plástico. Nueve a 14 días después de la transferencia de la olla, trasplantar cada planta con tierra en una olla de 1,5 galones.
Añadir un fertilizante de liberación controlada a la olla, y mantener las plantas en el invernadero. Cuando los brotes de oído comiencen a emerger de la planta, utilice una bolsa de tiro semitransparente para cubrir los brotes de modo que las sedas emergentes se puedan observar sin quitar la bolsa. A continuación, polinizar las plantas en la etapa apropiada de desarrollo como se demostró.
Las orejas de maíz generalmente se cosechan de nueve a 12 días después de la polinización. Los embriones inmaduros con longitudes que oscilan entre 1,5 y dos milímetros son los mejores explantes para la transformación de este protocolo. Ocho días después de la infección, los embriones somáticos que expresan ZsGreen pueden visualizarse mediante microscopía de fluorescencia.
El tratamiento térmico ocho días después de la infección induce la expresión de la cre recombinasa, lo que resulta en la escisión del gen morfogénico, cre, y los casetes de expresión ZsGreen flanqueados entre los dos sitios loxP. Después de tres a cuatro semanas de cultivo en medio de formación de brotes que contiene herbicidas, se pueden observar tejidos proliferantes con embriones madurantes o cogollos de brote resistentes al herbicida. Algunos de los tejidos resistentes a los herbicidas pueden ser negativos para ZsGreen, lo que sugiere que la escisión mediada por cre probablemente ocurrió en estos tejidos.
Después de mover los tejidos a medio de enraizamiento y la incubación ligera, se pueden cosechar brotes sanos, vigorosos y en crecimiento con raíces bien desarrolladas. Tenga en cuenta que algunos tejidos pueden parecer tener múltiples brotes posiblemente debido a plantas clonales que tienen patrones idénticos de integración transgénero. El método QuickCorn puede mejorar en gran medida la eficiencia de la transformación del maíz y ampliar la lista de genotipos transformables.
El protocolo puede ser reproducido con éxito por investigadores con una formación mínima en transformación del maíz. Usando el método QuickCorn, las plantas enraadas deben estar listas para transferirse al suelo en sólo cinco a siete semanas después del día de la infección. Preste atención a la composición media, el momento de las subculturas y las condiciones de temperatura e iluminación.
La calidad de los materiales de partida también es esencial para una transformación exitosa. Los productos químicos, la solución de lejía y el herbicida utilizados en este protocolo son biopeligrosos. Por favor, asegúrese de usar el equipo de protección personal apropiado durante su uso.
