诱导毛茸茸的根由农业细菌根- 在塔特里巴克麦的中介转化 （法戈皮鲁姆塔塔里库姆）

使用此协议，我们将演示首次诱导毛根在酸麦中的过程。这种技术对于开始基因组学和微生物学的酸麦和其他植物来说是一种简单而廉价的技术。虽然这种详细的方法为酸麦设置了，但它可以应用于其他二科植物，并作一些修改。

虽然此方法易于执行，但它有许多详细的步骤。视觉演示可以帮助研究人员实现更高效的毛根诱导。演示程序将是钱光涛，一个硕士学生从我实验室。

首先选择丰满和未损坏的酸麦种子，并在28摄氏度的水中浸泡种子约20分钟。当种子涂层易于去除时，将100至200颗去皮种子放入含有75%乙醇的100毫升锥形烧瓶中，30秒。在灭菌结束时，用5%次氯酸钠代替乙醇。

15分钟后，将次氯酸钠除掉，用无菌去离子水洗涤种子五次。然后用一块无菌的胆小纸把种子擦干。要获得酸麦苗，每瓶加入10个种子到单个300毫升植物组织培养瓶中，含有50毫升的MSSA培养剂。

然后，在25度，正负1摄氏度的光条件下，在文化室发芽的种子。7到10天后，选择有两块展开的幼苗，从根部切出幼苗。将幼苗放入无菌培养皿中，将低小血度切成0.8至1厘米的段。

将科蒂龙切成约0.5厘米的碎片，并在光条件下将产生的外植培养成24小时。第二天，将外植转移到消毒的100毫升圆锥烧瓶中。要激活 A.rhizogenes，先在冰上解冻培养，然后用抗生素将细菌均匀地电镀到 YEB 固体介质上，在 28 摄氏度下孵育 12 至 16 小时。

第二天早上，在一个新的培养皿中挑选一个单克隆殖民地进行养殖，正如刚刚证明的。再孵育12至16小时后，在含有20毫升YEB固体介质的灭菌100毫升圆锥形烧瓶中接种由此产生的单克隆菌群，并用抗生素在28摄氏度和每分钟200转16至18小时，直到600的光学密度达到2.0。然后将2-4%的细菌细胞培养转移到一个新的100毫升锥形烧瓶中，含有20毫升的新鲜YEB固体介质，用抗生素在28摄氏度和200转每分钟4至5小时，直到600纳米的光学密度达到约0.5。

为了诱导毛根转化，将 A.rhizogenes 培养基转移到无菌的 50 毫升锥形管中，通过离心收集细菌。将MSSAS介质中的颗粒重新悬浮到大约0.2的光学密度，并注入悬浮物到外植的烧瓶中。10分钟后，从烧瓶中取出植物，用一块无菌的围兜纸进行斑点。

然后将一块直径为9厘米的无菌滤纸放在一盘MSSAAS介质上，将滤纸覆盖在滤纸上，在黑暗中25摄氏度下进行为期三天的孵化。在孵育结束时，将大约20个受感染的外植移植到MSSACK介质上，并在25摄氏度的光条件下垂直孵育这些植物。经过10至14天的培养，选择毛质根，表现出白色的外观和快速生长，并切成两到三厘米的根。

清楚地编号在干净的长凳上的根。将根片在含有MSSK介质的100毫升圆锥形烧瓶中亚化，其温度为25摄氏度，在黑暗中每分钟80转，直到其溅到烧瓶底部。要识别毛茸茸的根，去除任何黄褐色和受污染的毛根，并选择那些与白色的外观。

如果使用记者基因，请在蓝色或浅紫色双紫光透光器下检查根部是否荧光，并选择具有强烈荧光信号的毛根。然后用吸水纸擦干根部，用标记的铝箔包裹，立即进行分析。对于长期储存，将根在液氮中冻干，并在零下80摄氏度处放置根部，直到其调查。

在基因转化和培养之后，如所证明的，毛质的根部将在外植的伤口位点中表现出蓬松的白色和质的光，并形成高度分枝和互锁的基质。记者基因可用于促进在蓝色或光的双紫外线透射下分化转基因毛发根，或识别感兴趣的靶基因。在这里，显示了在塔里麦毛根的转基因线中光诱导转录因子的相对表达。

值得注意的是，由于诱发转录因子过度表达，在代谢水平上也促进了鲁汀和奎塞汀的生物合成。此外，所有三条转基因线中黄酮类合成通路基因的相对基因表达明显高于对照组测量的基因，表明在酸麦外植中成功进行了毛根转化。即种子的感染、外植的挑选，以及细菌的浓度直接影响毛根诱导的成功。

我们可以评估基因表达、DNA蛋白或蛋白质反应或二次代谢物的大规模生产，以研究转录调控的二次代谢物。工程细菌对人类及其环境有害。小心正确处理、操作和处置细菌。