באמצעות פרוטוקול זה, אנו נדגים את תהליך צעד אחר צעד ל גרימת שורשים שעיר כוסמת טרטרי בפעם הראשונה. טכניקה זו היא קלה וזורה להתחלת גנומיקה ומיקרוביומיקה עבור כוסמת טרטרי וצמחים אחרים. למרות שיטה מפורטת זו מוגדרת כוסמת טרטרי, זה יכול להיות מיושם על צמחים אחרים dicot עם כמה שינויים.
למרות שיטה זו קל לבצע, יש לו שלבים מפורטים רבים. הדגמה חזותית יכולה לעזור לחוקרים להשיג אינדוקציה שורש שעיר יעיל יותר. הדגמת ההליך תהיה גואנגטאו צ'יאן, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.
התחל על ידי בחירת זרעי כוסמת טרטרי שמנמן ולא ניזוק השריית הזרעים ב 28 מעלות צלזיוס מים במשך כ 20 דקות. כאשר ניתן להסיר בקלות את מעיל הזרעים, מניחים 100 עד 200 זרעים קלופים לתוך בקבוק חרוט מעוקר 100 מיליליטר המכיל 75% אתנול במשך 30 שניות. בסוף הסטריליזציה, להחליף את האתנול עם 5%נתרן hypochlorite.
לאחר 15 דקות, decant hypochlorite נתרן ולשטוף את הזרעים עם מים סטריליים deionized חמש פעמים. ואז למחוק את הזרעים יבשים עם פיסת נייר ביבולי סטרילי. כדי להשיג שתילי כוסמת טרטריים, להוסיף 10 זרעים לבקבוק בודדים 300 מיליליטר צמח רקמת רקמות בקבוקים המכילים 50 מיליליטר של מדיום MSSA.
לאחר מכן, לנבוט את הזרעים בחדר תרבות ב 25, בתוספת או מינוס 1, מעלות צלזיוס בתנאי אור. לאחר 7 עד 10 ימים, בחר שתילים חזקים עם שתילים של cotyledons התגלגל לחתוך את השתילים מן השורשים. מניחים את השתילים בצלחת פטרי סטרילית וחותכים את ההיפוקוטילים למקטעים של 0.8 עד 1 ס"מ.
תפל את הקוטילדונים לחתיכות של כ-0.5 ס"מ ולתרבות מראש את המתפוצצים שנוצרים בתנאי תאורה למשך 24 שעות. למחרת, להעביר את המתפוצצים לתוך בקבוק חרוט מעוקר 100 מיליליטר. כדי להפעיל A.rhizogenes, להפשיר את התרבות על קרח לפני ציפוי שווה את החיידקים על אמצעי מוצק YEB עם אנטיביוטיקה עבור דגירה 12 עד 16 שעות ב 28 מעלות צלזיוס.
למחרת בבוקר, בחר מושבה חד-קלונאלית לתרבות בצלחת פטרי חדשה כפי שהוכח זה הרגע. לאחר דגירה נוספת של 12 עד 16 שעות, יש לחסן את המושבות המונוקלונאליות המתקבלות בבקבוק חרוט מעוקר של 100 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של מדיום מוצק של YEB עם אנטיביוטיקה ב-28 מעלות צלזיוס ו-200 מהפכות בדקה למשך 16 עד 18 שעות עד שהצפיפות האופטית ב-600 מגיעה ל-2.0. לאחר מכן להעביר 2-4% מתרבות התאים החיידקיים לתוך בקבוק חרוט חדש 100 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של מדיום מוצק YEB טרי עם אנטיביוטיקה ב 28 מעלות צלזיוס ו 200 מהפכות לדקה במשך 4 עד 5 שעות עד הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מגיע כ 0.5.
כדי לגרום לשינוי שורש שעיר, להעביר את התרבות A.rhizogenes לתוך צינור חרוט סטרילי 50 מיליליטר ולאסוף את החיידקים על ידי צנטריפוגה. יש להחדיר את גלולת הכדור במדיום MSSAS לצפיפות אופטית של כ-0.2 ולהחדיר את ההשעיה לתוך בקבוק המתפוצצים. לאחר 10 דקות, להסיר את explants מן הבקבוק כתם אותם עם פיסת נייר ביבולי סטרילי.
לאחר מכן מניחים פיסת נייר סינון סטרילית בקוטר 9 ס"מ על צלחת של מדיום MSSAAS ומפילים את המתפוצצים על נייר הסינון עבור דגירה של שלושה ימים ב-25 מעלות צלזיוס בחושך. בסוף הדגירה, להעביר כ 20 explants נגועים על MSSACK בינוני אנכית דגירה הצמחים בתנאי אור ב 25, בתוספת או מינוס 1, מעלות צלזיוס. לאחר 10 עד 14 ימים של תרבות, בחר את השורשים השעירות המדגימים מראה לבן וצמיחה מהירה וחתוך את השורשים לחתיכות של שניים עד שלושה סנטימטרים.
ברור למספר את השורשים על ספסל נקי. תת-תרבות את חתיכות השורש בבקבוק חרוט מעוקר 100 מיליליטר המכיל מדיום MSSK ב 25 מעלות צלזיוס ו 80 מהפכות לדקה בחושך עד שהם overspread לתחתית הבקבוק. כדי לזהות את השורשים השעירים, להסיר את כל שורשים שעירים tawny ו מזוהמים ולבחור אלה עם מראה לבן.
אם נעשה שימוש בגן כתב, בדוק את השורשים של פלואורסצנטיות תחת טרנסילומינטור כחול או אור כפול אולטרה סגול ובחר את השורשים השעירים המציגים אות פלואורסצנטי חזק. לאחר מכן לייבש את השורשים עם נייר סופג לעטוף אותם בנייר אלומיניום מסומן לניתוח מיידי. לאחסון לטווח ארוך, ליופילים את השורשים בחנקן נוזלי ומנחים את השורשים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לחקירה שלהם.
לאחר טרנספורמציה גנטית ותרבות, כפי שהוכח, השורשים השעירה יציגו צבע לבן רך ואופן פלגיטרופי באתרי הפצע של המתפוצצים ויצוו מטריצה מסועפת מאוד ושזורה. גן כתב יכול לשמש כדי להקל על ההידול של השורשים השעירים מהודר תחת טרנסילומינציה אולטרה סגולה כפולה כחולה או אור, או זיהוי של גן היעד של עניין. כאן מוצג הביטוי היחסי של גורם שעתוק הנגרם על ידי אור בקווים הטרנסגניים של שורשים שעריים של כוסמת טרטריים.
יש לציין כי הביוסינתזה של רוטין וקוורצטין מקודמת גם ברמה המטבולית בתגובה לדיכוי יתר של גורם שעתוק המושרה. יתר על כן, ביטוי הגנים היחסי של גנים מסלול סינתזה פלבנואידים בכל שלושת הקווים מהו מהוומניים, גבוהים להפליא מאלה שנמדדו בקבוצת הביקורת, המציין טרנספורמציה שורש שעיר מוצלח מתפוצץ כוסמת טרטרי. כלומר זיהום של הזרעים, הבחירה של explants, ואת הריכוז של החיידקים ישירות להשפיע על ההצלחה של אינדוקציה שורש שעיר.
אנו יכולים להעריך את ביטוי הגנים, חלבון DNA, או תגובות חלבון חלבון או ייצור המוני של מטבוליטים משניים כדי ללמוד מטבוליטים משניים ויסות שעתוק. החיידקים המהונדסים מסוכנים לבני אדם וסביבתו. יש לדאוג לטפל, לנתח ולהיפטר מהחיידקים כראוי.
