Usando este protocolo, demonstraremos o processo passo a passo para induzir raízes peludas no trigo tartário pela primeira vez. Esta técnica é fácil e barata para começar a genômica e microbiomia para trigo-sarraceno tartário e outras plantas. Embora este método detalhado seja configurado para trigo-sarraceno tartário, ele pode ser aplicado a outras plantas dicot com algumas modificações.
Embora este método seja fácil de executar, ele tem muitos passos detalhados. A demonstração visual pode ajudar os pesquisadores a alcançar uma indução de raiz pelente mais eficiente. Demonstrando o procedimento será Guangtao Qian, um estudante de mestrado do meu laboratório.
Comece selecionando sementes de trigo-trigo tartário gordurosas e não danificadas e absorvendo as sementes em água Celsius de 28 graus por aproximadamente 20 minutos. Quando o casaco de sementes puder ser facilmente removido, coloque 100 a 200 sementes descascadas em um frasco cônico esterilizado de 100 mililitros contendo 75% de etanol por 30 segundos. No final da esterilização, substitua o etanol por hipoclorito de 5%.
Após 15 minutos, decante o hipoclorito de sódio e lave as sementes com água deionizada estéril cinco vezes. Em seguida, borrique as sementes secas com um pedaço de papel bibuloso estéril. Para obter mudas de trigo tartário, adicione 10 sementes por garrafa a garrafas individuais de cultura de tecido vegetal de 300 mililitros contendo 50 mililitros de meio MSSA.
Em seguida, germine as sementes em uma sala de cultura aos 25, mais ou menos 1, graus Celsius sob condições de luz. Após 7 a 10 dias, selecione mudas robustas com duas peças de cotilledons desdobrados e corte as mudas das raízes. Coloque as mudas em uma placa de petri estéril e corte os hipocotils em segmentos de 0,8 a 1 centímetro.
Sheer the cotyledons em aproximadamente 0,5 centímetros de peças e pré-cultura as explantas resultantes sob condições de luz por 24 horas. No dia seguinte, transfira as explantas para um frasco consírico esterilizado de 100 mililitros. Para ativar A.rizogenes, descongele a cultura no gelo antes de emplacar uniformemente as bactérias no meio sólido YEB com antibióticos para uma incubação de 12 a 16 horas a 28 graus Celsius.
Na manhã seguinte, escolha uma colônia monoclonal para cultura em uma nova placa de petri como acabou de demonstrar. Após mais 12 a 16 horas de incubação, inocular as colônias monoclonais resultantes em um frasco consílico esterilizado de 100 mililitros contendo 20 mililitros de yeb médio sólido com antibióticos a 28 graus Celsius e 200 revoluções por minuto por 16 a 18 horas até que a densidade óptica em 600 atinja 2,0. Em seguida, transfira 2-4% da cultura celular bacteriana para um novo frasco cônico de 100 mililitros contendo 20 mililitros de meio sólido YEB fresco com antibióticos a 28 graus Celsius e 200 revoluções por minuto por 4 a 5 horas até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja aproximadamente 0,5.
Para induzir a transformação da raiz pelrosa, transfira a cultura A.rizogenes em um tubo cônico estéril de 50 mililitros e colete as bactérias por centrifugação. Resuspenque a pelota em mssas médio para uma densidade óptica de aproximadamente 0,2 e infunda a suspensão no frasco de explants. Após 10 minutos, retire as explantas do frasco e borre-as com um pedaço de papel bibuloso estéril.
Em seguida, coloque um pedaço estéril de 9 centímetros de diâmetro de papel filtro sobre um prato de mssaas médio e sobreponha as explantas no papel filtro para uma incubação de três dias a 25 graus Celsius no escuro. Ao final da incubação, transfira aproximadamente 20 explantas infectadas para o mssack médio e verticalmente incubar as plantas em condições leves a 25, mais ou menos 1, graus Celsius. Após 10 a 14 dias de cultura, selecione as raízes peludas demonstrando uma aparência branca e crescimento rápido e corte as raízes em pedaços de dois a três centímetros.
Claramente numera as raízes em um banco limpo. Subcultura as peças radiculares em um frasco consílico esterilizado de 100 mililitros contendo mSK médio a 25 graus Celsius e 80 revoluções por minuto no escuro até que se espalharam para o fundo do frasco. Para identificar as raízes peludas, remova as raízes peludas e contaminadas e selecione aquelas com aparência branca.
Se um gene repórter foi usado, verifique as raízes quanto à fluorescência sob um transilluminator ultra violeta azul ou leve e selecione as raízes peluadas que exibem um forte sinal fluorescente. Em seguida, seque as raízes com papel absorvente e enrole-as em papel alumínio marcado para análise imediata. Para armazenamento a longo prazo, lyophilize as raízes em nitrogênio líquido e coloque as raízes a menos 80 graus Celsius até sua investigação.
Após a transformação genética e a cultura, como demonstrado, as raízes peludas exibirão uma cor branca fofa e uma forma plagiotrópico nos locais de ferida das explantas e formarão uma matriz altamente ramificada e entrelaçada. Um gene repórter pode ser usado para facilitar a diferenciação das raízes peluadas transgênicas sob uma transilluminação ultravioleta ultravioleta azul ou leve, ou a identificação de um gene alvo de interesse. Aqui, mostra-se a expressão relativa de um fator de transcrição induzido pela luz nas linhas transgênicas de raízes peludas tartárias.
Notavelmente, a biossíntese de rutina e quercetina também são promovidas no nível metabólico em resposta à superexpressão do fator de transcrição induzida. Além disso, a expressão genética relativa dos genes da síntese flavenóide em todas as três linhas transgênicas, são notavelmente maiores do que as medidas no grupo controle, indicando uma transformação de raiz pelada bem sucedida em explantas tartárias de trigo sarraceno. Isso é infecção das sementes, seleção das explantas, e a concentração das bactérias afetam diretamente o sucesso da indução da raiz pelêgica.
Podemos avaliar a expressão genética, a proteína do DNA ou reações proteicas ou a produção em massa de metabólitos secundários para estudar metabólitos secundários de regulação transcricional. As bactérias projetadas são perigosas para os humanos e seu ambiente. Tome cuidado para manusear, operar e descartar as bactérias corretamente.
