Используя этот протокол, мы впервые продемонстрируем шаг за шагом процесс индуцирования волосатых корней в тартари гречневой крупе. Этот метод является простым и недорогим для начала геномики и микробиомики для тартари гречихи и других растений. Хотя этот подробный метод настроен для тартари гречихи, он может быть применен к другим растениям дикот с некоторыми изменениями.
Хотя этот метод прост в работе, он имеет много подробных шагов. Визуальная демонстрация может помочь исследователям достичь более эффективной индукции волосатого корня. Демонстрацией процедуры будет Гуантао Цянь, студент магистратуры из моей лаборатории.
Начните с выбора пухлые и неповрежденные семена гречихи тартар и замачивания семян в 28 градусов по Цельсию воды в течение примерно 20 минут. Когда семенной слой можно легко удалить, поместите от 100 до 200 очищенных семян в стерилизованную 100 миллилитровую коническую колбу, содержащую 75% этанола в течение 30 секунд. В конце стерилизации замените этанол 5%-ным гипохлоритом натрия.
Через 15 минут, декант гипохлорита натрия и мыть семена стерильной деионизированной водой пять раз. Затем промокнете семена сухими с куском стерильной бибуховой бумаги. Чтобы получить саженцы тартари гречихи, добавьте 10 семян на бутылку в отдельные 300 миллилитров растительных тканей культуры бутылки, содержащие 50 миллилитров MSSA среды.
Затем прорастают семена в комнате культуры на 25, плюс-минус 1, градусов по Цельсию в условиях света. Через 7-10 дней выберите крепкие саженцы с двумя кусочками развернутого котилендона и вырежьте саженцы из корней. Поместите рассаду в стерильную чашку Петри и разрежьте гипокотилы на сегменты от 0,8 до 1 сантиметра.
Чисто cotyledons в приблизительно части 0.5 сантиметра и pre-культура приводящ к explants под светлыми условиями на 24 часа. На следующий день перенесите экспланты в стерилизованную 100-миллилитровую коническую колбу. Чтобы активировать A.rhizogenes, оттепель культуры на льду, прежде чем равномерно покрытие бактерий на YEB твердой среде с антибиотиками для 12 до 16 часов инкубации при 28 градусов по Цельсию.
На следующее утро, выбрать моноклональной колонии для культуры в новом чашке Петри, как только что продемонстрировали. После еще 12 до 16 часов инкубации, привить в результате моноклональных колоний в стерилизованной 100 миллилитров конической колбы, содержащей 20 миллилитров YEB твердой среды с антибиотиками при 28 градусов по Цельсию и 200 оборотов в минуту в течение 16 до 18 часов, пока оптическая плотность на 600 достигает 2,0. Затем перенесите 2-4% культуры бактериальных клеток в новую коническую колбу на 100 миллилитров, содержащую 20 миллилитров свежей твердой среды YEB с антибиотиками при 28 градусах Цельсия и 200 оборотов в минуту в течение 4-5 часов, пока оптическая плотность на 600 нанометров не достигнет примерно 0,5.
Чтобы вызвать трансформацию волосистого корня, перенесите культуру A.rhizogenes в стерильную 50-миллилитровую коническую трубку и соберите бактерии путем центрифугации. Переусердуйте гранулы в среде MSSAS до оптической плотности примерно 0,2 и влить суспензию в колбу эксплантов. Через 10 минут, удалить explants из колбы и пятно их с куском стерильной библионной бумаги.
Затем поместите стерильный 9-сантиметровый кусок фильтровальной бумаги на блюдо msSAAS среды и наложить explants на фильтровальную бумагу в течение трех дней инкубации при 25 градусов по Цельсию в темноте. В конце инкубации перенесите около 20 зараженных эксплантов на средний MSSACK и вертикально инкубировать растения в условиях света при температуре 25, плюс-минус 1, градусов по Цельсию. После 10 до 14 дней культуры, выберите волосатые корни, демонстрирующие белый вид и быстрый рост и разрезать корни на два-три сантиметра штук.
Очевидно, номер корни на чистой скамейке. Субкультура корневых кусочков в стерилизованной 100 миллилитровой конической колбе, содержащей MSSK среды при 25 градусов по Цельсию и 80 оборотов в минуту в темноте, пока они не перехлебнулись до нижней части колбы. Чтобы определить волосатые корни, удалить любые рыжие и загрязненные волосатые корни и выбрать те, с белым внешним видом.
Если был использован ген репортера, проверьте корни на флуоресценцию под синим или легким двойным ультрафиолетовым трансилюминатором и выберите волосатые корни, которые демонстрируют сильный флуоресцентный сигнал. Затем высушите корни абсорбющей бумагой и заверните их в маркированную алюминиевую фольгу для немедленного анализа. Для длительного хранения, лиофилизируют корни в жидком азоте и место корни на минус 80 градусов по Цельсию до их исследования.
После генетической трансформации и культуры, как попродемонстрировано, волосатые корни будут проявлять пушистый белый цвет и плагиотропной манере в ране сайтов explants и образуют высоко разветвленной и взаимосвязанной матрицы. Ген репортера может быть использован для облегчения дифференциации трансгенных волосатых корней под синим или легким двойным ультрафиолетовым трансиллюминацией, или для идентификации целевого гена интереса. Здесь показано относительное выражение светового транскрипционные факторы в трансгенных линиях тартарных гречневых волосатых корней.
Примечательно, что биосинтез рутина и кверцетина также пропагандируется на метаболическом уровне в ответ на индуцированное фактор транскрипции переэкспрессии. Кроме того, относительная экспрессия генов пути синтеза флавеноидов во всех трех трансгенных линиях на удивление выше, чем в контрольной группе, что свидетельствует об успешной трансформации волосатого корня в тартарных эксплантах гречихи. То есть инфекция семян, отбор эксплантов и концентрация бактерий напрямую влияют на успех волосатой индукции корня.
Мы можем оценить экспрессию генов, белок ДНК, или белковые реакции или массовое производство вторичных метаболитов для изучения транскрипционные регуляции вторичных метаболитов. Инженерные бактерии опасны для человека и его окружения. Позаботьтесь, чтобы справиться, работать, и распоряжаться бактериями должным образом.
